Реакція зв'язування комплементу із нирковим антигеном. Складні реакції імунодіагностики

Сторінка 33 з 91

Реакція зв'язування комплементу (РЗК)
З'єднання антитіла з антигеном та комплементом не обов'язково супроводжується руйнуванням антигену. Це. більшою мірою відноситься до мікробів, які виявляють стійкість до літичної дії комплементу. Зв'язування комплементу, що відбувається в таких випадках, може бути виявлено непрямим шляхом за допомогою методу, відкритого Ж. Борде і С. Жангу. Сутність методу ось у чому. При взаємодії імунної сироватки зі специфічним антигеномвідбувається з'єднання антигену з антитілом, утворюється комплекс антитіла з антигеном, який пов'язує комплемент. У разі невідповідності антигену та антитіла зв'язування комплементу не відбувається, тобто комплемент залишається вільним. Процес зв'язування комплементу за позитивної реакції антитіла з антигеном залишається невидимим. Тому для визначення, чи зв'язався комплемент або залишився вільним, як індикатор в реакцію вводиться гемолітична система (гемолітична сироватка - гемолізини та еритроцити барана). Реакція зв'язування комплементу ставиться у дві фази: у першій фазі до досліджуваної сироватці (антитілу) додається антиген та комплемент, у другій – додається гемолітична система.
Якщо в першій фазі реакції досліджувана сироватка містить специфічні антигену антитіла, то комплемент буде пов'язаний з комплексом антиген+антитіло, при додаванні гемолітичної системи гемоліз не відбудеться і реакція буде вважатися позитивною.
Якщо ж досліджувана сироватка не містить специфічних антитіл, тобто антиген та антитіла не відповідають один одному, тоді комплемент у першій фазі реакції залишається вільним і при додаванні гемолітичної системи відбудеться гемоліз (розчинення) еритроцитів, тобто реакція буде негативною (див. .мал. 57).
Реакція Борде-Жангу (реакція зв'язування комплементу), що має високою чутливістю, придбала велике діагностичне значення. Це значення ще більше збільшилося, коли Жангу показав, що реакція може відбуватися не тільки з бактеріальними тілами, а й з екстрактами. Реакція Борде-Жангу застосовується при діагностиці сапу, гонореї та інших захворювань. А. Вассерман, з ідеї Ж. Борде, застосував реакцію зв'язування комплементу для серодиагностики, сифілісу. Ця реакція отримала практичне застосуванняу розпізнаванні сифілісу.
Реакція зв'язування комплементу застосовується з двоякою метою:

1. Для виявлення у сироватці специфічних антитіл за допомогою відомого антигену. Наприклад, маючи антиген, приготований з культури гонокока, можна виявити гонококові антитіла в сироватці хворого. У цьому випадку необхідно користуватись антигеном, доза якого, що зв'язує комплемент, заздалегідь титрована на значній кількості сироваток хворих.
2. Для визначення виду антигену за допомогою сироватки, що містить антитіла до певного антигену. Наприклад, за допомогою відповідної імунної сироватки можна ідентифікувати паличку кашлюку. У цих випадках необхідно мати сильну сироватку імунну, титр якої відомий.

Інгредієнти (складові частини) реакції. Для реакції зв'язування комплемента необхідні такі інгредієнти: 1) еритроцити барана, 2) гемолітична сироватка, 3) комплемент, 4) антиген і 5) випробувана сироватка.
1. Еритроцити отримують з дефібринованої крові барана. Для цього у барана беруть кров із яремної вени безпосередньо у банку зі скляними намистами. Струшують протягом 10 хвилин. Проціджують через стерильну марлю, центрифугують і відсмоктують сироватку. Три рази відмивають еритроцити від залишку сироватки фізіологічним розчиномхлористого натрію центрифугування протягом 10-15 хвилин. Після третього центрифугування з осаду готують 3% завись еритроцитів для досвіду. При зберіганні у льодовику дефібринована кров може вживатися протягом 6-8 днів.

Схема приготування розведень гемолітичної сироватки з основного розведення 1:100

1. Гемолітична сироватка зазвичай виходить від кролів, імунізованих еритроцитами барана. Гемолітичну сироватку випускають у сухому вигляді інститути бактерійних препаратів. На етикетці ампули вказаний титр сироватки та термін придатності.

Таблиця 4
Схема титрування гемолітичної сироватки

Титром гемолітичної сироватки називається її граничне розведення, здатне об'ємом 0,5 мл розчинити 0,5 мл 3% суспензії еритроцитів у присутності 0,5 мл комплементу протягом години при температурі 37°.
Титр гемолітичної сироватки визначається за наступною схемою: готують основне розведення виворіт 1: 100 (0,1 мл сироватки+0,9 мл фізіологічного розчину), з якого готують подальші розведення (табл. 3).
У ряд пробірок послідовно відмірюють по 0,5 мл отриманих розведень гемолітичної сироватки, починаючи з 1: 1000, додають у кожну пробірку по 0,5 мл комплементу, розведеного 1:10, і 0,5 мл 3% суспензії еритроцитів. Титрування гемолітичної сироватки проводиться за схемою (табл. 4).
Зі схеми видно, що ця сироватка ще в розведенні 1: 1500 дає повний гемоліз (тобто титр сироватки 1: 1500). Надалі для досвіду беруть у 3 рази менше розведення (потрійний титр). Так, наприклад, якщо титр гемолітичної сироватки 1: 1500, застосовується розведення 1:500 (тобто 0,1 мл сироватки 49,9 мл фізіологічного розчину).

1. Комплементи. Як комплемент у реакції служить сироватка морських свинок(їх комплемент має найбільшою активністю) або сухий комплемент, що випускається інститутами бактерійних препаратів.

Так як ступінь активності комплементу не у всіх морських свинок однаковий, необхідно брати кров у кількох тварин та отримані сироватки змішувати.
Титром комплементу позначається перша мінімальна доза комплементу, яка розчиняє еритроцити. Якщо, наприклад, у наведеній схемі титрування повний гемоліз відбувся в пробірці, що містить 0,3 мл комплементу, і неповний гемоліз опинився в пробірці, що містить 0,25 мл комплементу, то титром комплементу слід вважати 0,3 мл у розведенні 1: 10. Як робоча доза комплементу зазвичай береться титр його, збільшений на 20-25%, тобто приблизно це відповідає тій кількості комплементу, яке міститься в передостанній пробірці з гемолізом.
Як при титруванні гемолітичної сироватки, так і при титруванні комплементу ставляться два контролі (див. табл. 5).

Схема титрування комплементу без антигену


Таблиця 6
Схема титрування комплементу у присутності антигену

Крім того, рекомендується титрувати комплемент також у присутності антигену.
Титрування комплементу в присутності антигену необхідне у випадках, коли антиген пригнічує титр комплементу (антикомплементарна властивість антигену). Ця властивість може залежати як від природи антигену, так і від способу його приготування.

1. Антиген. У реакції зв'язування комплементу використовуються різні антигени. Антигенами є культури різноманітних мікробів або екстракти патологічно змінених чи нормальних тканин. Як бактеріальний антиген можуть використовуватися як суспензії мікробів у фізіологічному розчині, так і екстракти з мікробів, приготовані різними способами (наприклад, антиформіновий гонококовий антиген, спиртовий туберкульозний тощо). Хорошими антигенними властивостями має мікробна суспензія, попередньо вбита парами формаліну або оброблена алкоголем. Для реакції вихідну завись антигену розводять за оптичним стандартом, що містить. 1 млрд. мікробних тіл в 1 мл, і беруть обсягом 0,5 мл.

Як антиген застосовують також мікробні лізати в дистильованій воді або фізіологічному розчині, отримані в шюттель-апараті (апарат для струшування) або шляхом обробки антиформіном.
Для реакції слід вживати таку дозу антигену, яка викликає повну затримку гемолізу з сироватками, що містять відповідні гемолізини, але сама по собі затримки гемолізу не дає. В силу того, що всі мікробні антигени адсорбують якусь кількість комплементу, перед титруванням їх перевіряють на антикомплементарні властивості, визначаючи розчинну дозу комплементу, тобто найбільшу кількість антигену, яке не викликає затримки гемолізу. Визначення такої дози розчинника антигену проводиться за схемою (табл. 7).
З таблиці видно, що в даному прикладі доза розчиняє антигену становить 0,4 мл. Для досвіду беруть половину такої дози, тобто орієнтовна доза дорівнюватиме 0,2 мл.

1. Випробувана сироватка. Сироватку хворого відокремлюють від згустку через 3-48 годин після взяття крові та інактивують у водяній бані при 56° протягом 30 хвилин.

Таблиця 7 Схема визначення розчинної дози антигену

Інактивовані сироватки можуть зберігатися у холодильнику протягом 5-6 днів. Для реакції сироватка хворого застосовується у розведенні 1:5 (0,1 мл сироватки+0,4 мл фізіологічного розчину).
Постановка досвіду реакції зв'язування комплементу (табл. 8).
Для встановлення реакції зв'язування комплементу необхідні наступні інгредієнти:

1. фізіологічний розчин (0,85%);
2. сироватка, що підлягає дослідженню, інактивована при 56° протягом 30 хвилин у водяній бані;
3. антиген (завись бактерій або екстракт з них), що не викликає самостійно ні гемолізу, ні затримки його в дозі, встановленій титруванням;
4. комплемент у робочій дозі, встановленій титруванням;
5. гемолітична сироватка у дозі, що відповідає її потрійному титру;
6. 3% завись баранячих еритроцитів.

Кожен із інгредієнтів, який застосовується для реакції, береться у кількості 0,5 мл. Якщо доза окремого компонента менша від цього обсягу, то її доповнюють фізіологічним розчином до 0,5 мл.
Основний досвід зв'язування комплементу бажано ставити одразу з двома - трьома антигенами, приготовленими у різний спосіб (А1, А2, А3 у табл. 8).

Схема основного досвіду

Для контролю необхідно одночасно ставити реакцію точно в тих же умовах з нормальною сироваткою і сироваткою, що дає позитивний результат. При постановці реакції спочатку змішують досліджувану сироватку, антиген та комплемент. Суміш витримують при 37° протягом години. Після закінчення зазначеного терміну пробірку додають суміш гемолітичної сироватки і еритроцитів - гемолітичну систему. Гемолітичну систему додають або безпосередньо після приготування суміші з рівних обсягів гемолітичної сироватки та еритроцитів, або після півгодинного витримування цієї суміші в термостаті. Суміш усіх інгредієнтів після енергійного струшування поміщають у термостат при 37° на 1 годину, а потім на 12 годин переносять у холодильник або залишають при кімнатній температурі.
У пробірках, у яких відбувся гемоліз, рідина стає прозорою, але забарвленою (див. рис. 58).

Мал. 58. Схема реакції зв'язування комплементу.
а – реакція позитивна; б – реакція негативна.

Результат реакції позначається або словами "позитивна", "негативна" реакція, або знаком плюс (+) або мінус (-). Але так як ступінь затримки гемолізу може коливатися в межах від повної затримки до слабкої, позначення можуть бути наступні:
(++ + +)-повна затримка гемолізу; рідина не забарвлена; значний осад еритроцитів;
(+++) -ясна затримка гемолізу; рідина забарвлена, осад еритроцитів;
(++)-часткова затримка гемолізу; рідина забарвлена ​​інтенсивно; компактний осад еритроцитів;
(+)-дуже слабка затримка гемолізу; рідина забарвлена ​​інтенсивно, невеликий осад;
(±) -сліди затримки гемолізу, при збовтуванні помітний незначний осад;
(-)-Повний гемоліз (негативна реакція).

(РСК) Запропоновано Ж. Бордета О. Жангу. Реакція містить дві фази (рис. 10-18).

У фазі I (специфічної) реакції зв'язування комплементу (РЗК)шуканий Аг (або AT) реагує з діагностичною антисироваткою (або Аг-діагностикумом) та комплементом. Утворений комплекс Аг-АТ пов'язує комплемент.

У фазі II (індикаторної) реакції зв'язування комплементу (РЗК)визначають наявність вільного комплементу внесенням у реакційне середовище гемолітичної системи - еритроцитів барана та гемолітичної сироватки, що містить AT до них. Якщо Аг та AT не відповідають один одному і не утворюють імунних комплексів, то зв'язування комплементу не відбувається. В цьому. у разі вільний комплемент взаємодіє з компонентами гемолітичної системи, фіксуючись на комплексі еритроцит-антиеритроцитарне AT. Наслідок цього – гемоліз індикаторних клітин (феномен «лакової крові») – реакцію вважають негативною.

Якщо у фазі I реакції зв'язування комплементу (РЗК) AT і Аг відповідають один одному, то імунні комплекси, що утворюються, пов'язують комплемент, руйнування еритроцитів після внесення гемолітичної системи не спостерігають і реакцію вважають позитивною. Основні недоліки РСК: складність (включає 5 компонентів), лабільність деяких компонентів [їх необхідно готувати прямо перед постановкою реакції (комплемент) або за кілька діб (еритроцити барана)] та можливі антикомплементарні властивості сироваток і Аг. Проте РСК застосовують у діагностиці багатьох захворювань, наприклад, при діагностиці сифілісу (реакція Вассерманна).

РСК широко використовують для лабораторної діагностикивенеричних хвороб, рикетсіозів, вірусних інфекцій. Реакція протікає дві фази. Перша фаза- взаємодія антигену та антитіл за обов'язкової участі комплементу. Друга- Виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана та гемолітична сироватка). Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо комплемент адсорбувався раніше на комплексі антиген-антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає. За наявності в досліджуваній сироватці антитіл, комплементарним антигену, що утворюється комплекс антиген-антитіло пов'язує (адсорбує) на собі комплемент. При додаванні гемолітичної системи гемолізу не відбувається (затримка гемолізу ) , т.к. весь комплемент витрачено на специфічний зв'язок комплексу антиген-антитіло, а еритроцити залишилися незмінними. За відсутності в сироватці антитіл, комплементарним антигену, специфічний комплекс антиген-антитіло не утворюється і комплемент залишається не пов'язаним. Тому при додаванні гемолітичної системи комплемент приєднується до неї. Результатом реакції у цьому випадку буде гемоліз еритроцитів – у пробірках утворюється так звана «лакова» кров.

Мал. 6. Схема РСК: а- індикаторна система (еритроцити барана та антитіла до них) у присутності комплементу визначається у вигляді гемолізу; б- із сироваткою хворого діагностикум (Аг) утворює імунні комплекси та активує комплемент, результат – затримка гемолізу; в- у сироватці здорової людиниантитіл немає, комплемент активується індикаторною системою, результат – гемоліз.

Реакції із застосуванням мічених ат і аг

Реакції з використанням мічених антитіл та антигенів складають основу методів експрес-діагностики інфекційних захворювань, оскільки виявляють мінімальний вміст Аг та Ат у досліджуваних зразках. Як мітки можуть бути використані різні ферменти, барвники флюорохроми та ізотопи.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ) Даний метод є експресним та високочутливим. Існують два його різновиди. При прямомуметод до досліджуваної суспензії мікробів, фіксованої на склі, додають сироватку, мічену флуорохромом. Утворений комплекс антиген-антитіло при освітленні ультрафіолетовими (синьо-фіолетовими) променями дає яскраво-зелене свічення. При непрямомуРІФ використовують звичайні діагностичні сироватки проти будь-якого виду мікробів. Додавання цієї сироватки до випробуваної суспензії мікробів викликає утворення комплексу антиген-антитіло. Цей комплекс виявляється за допомогою універсальної флюоресцентної сироватки, що містить антитіла до гаммаглобулінової фракції крові того виду тварини, від якої була отримана діагностична сироватка. Комплекс, що світиться, виявляють при люмінесцентній мікроскопії.

Мал. 7. Реакція імунофлюоресценції (схема).

Імуноферментний аналіз (ІФА) В основі імуноферментного аналізу лежить відома імунна реакція антигену та антитіла. Один з цих реагентів є визначальним речовиною, а інший - дізнається, що володіє відомою стандартною специфічністю (виборчістю) по відношенню до речовини, що визначається. Для виявлення імунних комплексів, що утворилися (антиген-антитіло) використовується фермент, яким попередньо мітиться компонент, що дізнається (антиген або антитіло). Сам фермент, природно, не видно, тому візуалізація присутності речовини, що визначається методом ІФА, досягається застосуванням посередника. хромогену. Це особлива хімічна сполука, яка добре розчинна у воді, і розчин якої безбарвний. Перетворення безбарвного хромогену в кольорова речовина хромофорвідбувається під дією ферменту, котрим хромоген є субстратом.

Мал. 8. Імуноферментний аналіз (схема).

Аутоантигени- речовини, що мають здатність викликати імунні реакції в організмі, з якого вони отримані. Їх містять мозок, кришталик ока, сперматозоїди, паращитовидні залози, гомогенати насіннєвої залози, шкіри, нирок, печінки та інших тканин. Так як у звичайних умовах аутоантигени не приходять у зіткнення з імунними системамиорганізму, антитіла до подібних клітин та тканин не утворюються. Однак при пошкодженні цих тканин аутоантигени можуть всмоктуватися і викликати утворення антитіл, що надають шкідливу дію на відповідні клітини. Аутоантигени можуть виникати також з клітин деяких органів і тканин під впливом охолодження, медикаментозного впливу, вірусних інфекцій, бактеріальних білків і токсинів, наприклад стрептококів, стафілококів, мікобактерії туберкульозу та інших факторів. Вони утворюються у разі внаслідок порушення видової специфічності власних антигенів організму.

Антитіла, будучи складними молекулами глікопротеїдів, самі по собі також є антигенами. У їхньому складі розрізняють три типи антигенних детермінантів (елітипів): ізотипи, алотипи та ідіотипи.

Ізотипи - детермінанти, якими розрізняються класи і підкласи важких ланцюгів і варіанти каппа- і лямбда- легких ланцюгів.

Алотипи - детермінанти, що кодуються алелями цього імуноглобулінового гена.

Ідіотипи – антигенні детермінанти, що утворюються активними центрами молекул антитіл.

На клас IgG припадає близько 75% загальної кількості всіх імуноглобулінів сироватки крові людини.

Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що відповідно один одному антигени і антитіла утворюють імунний комплекс, до якого через Fc-фрагмент антитіл приєднується комплемент (С), тобто відбувається зв'язування комплементу комплексом антиген-антитіло. Якщо ж комплекс антиген-антитіло не утворюється, то комплемент залишається вільним.

Специфічна взаємодія АГ та AT супроводжується адсорбцією (зв'язуванням) комплементу. Оскільки процес зв'язування комплементу не проявляється візуально, Ж. Борде та О. Жангу запропонували використовувати як індикатор гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка показує, чи комплемент фіксований комплексом АГ-АТ. Якщо АГ і AT відповідають одне одному, т. е. утворився імунний комплекс, то комплемент пов'язується цим комплексом і гемолізу немає. Якщо AT відповідає АГ, то комплекс не утворюється і комплемент, залишаючись вільним, з'єднується з другою системою і викликає гемоліз.

Перебіг реакції

Реакція протікає у дві фази за участю двох систем; бактеріальної та гемолітичної. У першій реакції (специфічна) беруть участь антиген 4+ антитіло + комплемент. Позитивний результат реакції, що настає відповідно антитіл антигену, характеризується утворенням специфічного бактеріального комплексу антиген - антитіло з адсорбованим, або, як кажуть, «пов'язаним», комплементом. Залишаючись невидимим, комплекс не викликає жодних зовнішніх змінтого середовища, в якому він утворився. Негативний результат РЗК має місце за відсутності специфічної спорідненості між антигеном і антитілом сироватки і характеризується збереженням вільного активного комплементу. Перша фаза РЗК може проводитися в термостаті при 37°С (1-2 год) або в холодильнику при 3-4°С (18-20 год). При тривалому утворенні імунного комплексу антиген-антитіло на холоді відбувається повніше зв'язування комплементу і внаслідок цього чутливість реакції збільшується. При постановці порівняльних дослідів радянським імунологом акад. В. І. Іоффе та його учнями було показано, що в умовах тривалого зв'язування комплементу на холоді можна вловити у 100-500 разів менші кількості антигену та отримати позитивні результати при великих розведеннях імунної сироватки, ніж у досвіді зв'язування комплементу при температурі 37 °С протягом 1-2 год. Друга фаза реакції (індикаторна) відбувається між реагентами гемолітичної системи (суміш 3% суспензії еритроцитів та гемолітичної сироватки в рівних об'ємах) при температурі 37 °С тільки за наявності комплементу, що залишився вільним від першої фази реакції (реакція негативна . За відсутності вільного активного комплементу гемолізу еритроцитів під дією специфічних гемолізинів не настає (позитивна реакція).

Компоненти

Реакція зв'язування комплементу відноситься до складних серологічних реакцій. Для її проведення необхідні 5 інгредієнтів, а саме: АГ, AT та комплемент (перша система), еритроцити барана та гемолітична сироватка (друга система).

Антигеном для РЗК можуть бути культури різних вбитих мікроорганізмів, їх лізати, компоненти бактерій, патологічно змінених і нормальних органів, тканинних ліпідів, віруси та матеріали, що містять вірус.

Як комплемент використовують свіжу або суху сироватку морської свинки.

Механізм реакції

РСК проводять у дві фази: 1-а фаза - інкубація суміші, що містить три компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2-я фаза (індикаторна) - виявлення суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана, і гемолітичної сироватки, що містить антитіла до них. У 1-й фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв'язування ним комплементу, і тоді у 2-й фазі гемолізу сенсибілізованих антитілами еритроцитів не відбудеться; реакція позитивна. Якщо антиген та антитіло не відповідають один одному (у досліджуваному зразку немає антигену чи антитіла), комплемент залишається вільним і у 2-й фазі приєднається до комплексу еритроцит – антиеритроцитарне антитіло, викликаючи гемоліз; реакція негативна.

Застосування

Реакцію зв'язування комплементу можна застосовувати для:
1) виявлення специфічних антитіл у невідомій сироватці на підставі взаємодії їх із антигеном відомої природи;
2) вивчення властивостей антигену реакції з відомою специфічною сироваткою. Підготовка інгредієнтів для постановки РЗК.

1. Сироватку крові, отриману для дослідження, напередодні постановки реакції прогрівають у водяній бані при 56°С протягом 30 хв для інактивації її власного комплементу. Інактивована сироватка може зберігатись при температурі 3-4°С протягом 5-6 днів. У день постановки-досвіду сироватку розводять ізотонічним розчином натрію хлориду у співвідношенні 1:5 (0,1 мл досліджуваної сироватки,+ 0,4 мл ізотонічного розчину хлориду натрію).

2. Антигеном для постановки РСК можуть бути культури різноманітних мікробів, бактеріальні білки та екстракти, отримані з мікробних культур, патологічно змінених та нормальних органів та тканин. Особливості приготування антигену визначаються характером інфекційного процесу та особливостями його збудника.

3. Комплементом є суміш сироваток, отримана від 3-5 здорових морських свинок, або сухий комплемент у ампулах.

Безпосередньо перед вживанням сироватку морської свинки розводять ізотонічним розчином хлориду атрію щодо 1: 10, отримуючи основний розчин.

4. Гемолітичну сироватку перед постановкою досліду інактивують прогріванням при температурі 56 °С протягом 30 хв. Для встановлення основного досвіду РСК, а також для титрування комплементу та антигену застосовують гемолітичну сироватку в потрійному титрі. Наприклад, якщо титр гемолітичної сироватки 1: 1800, реакції застосовують розведення сироватки 1: 600.

5. Еритроцити одержують з дефібринованої крові барана. Кров видалення плівок фібрину фільтрують через тришаровий марлевий фільтр. Отриманий фільтрат центрифугують, сироватку відсмоктують і зливають, а еритроцити промивають 3-4-кратним центрифугуванням з ізото - ним розчином хлориду натрію. При останньому промиванні еритроцитів надосадовий шар рідини має бути абсолютно прозорим. З відмитих еритроцитів готують 3% завись в ізотонічному розчині хлориду натрію. Підготувавши вказаним вище способом інгредієнти, що беруть участь у РЗК, приступають до титрування гемолітичної сироватки, комплементу та антигену.

Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що специфічний комплекс антиген - антитіло завжди адсорбує у собі (зв'язує) комплемент.

Цю реакцію широко застосовують при ідентифікації антигенів та в серодіагностиці інфекцій особливо захворювань* викликаних спірохетами (реакція Вассермана), рикетсіями та вірусами.

РСК – складна серологічна реакція. У ній беруть участь комплемент та дві системи антиген – антитіло. Фактично, це дві серологічні реакції.

Перша система - основна складається з антигену і антитіла (один відомий, інший немає). До неї додають певну кількість комплементу. За відповідністю антигену та антитіла цієї системи вони з'єднаються та зв'яжуть комплемент. Комплекс, що утворився, дрібнодисперсний і не видно.

Про утворення цього комплексу дізнаються за допомогою другої гемолітичної системи або індикаторної. До неї входять еритроцити барана (антиген) та відповідна їм гемолітична сироватка (антитіло), тобто готовий імунний комплекс. У цій системі лізис еритроцитів може статися лише у присутності комплементу. Якщо комплемент пов'язаний першою системою (відповідно до неї антигену і антитіла), то в другій системі гемолізу не буде - тому що немає вільного комплементу. Відсутність гемолізу (вміст каламутної пробірки або на дні її осад еритроцитів) реєструють як позитивний результат РСК.

Якщо першій системі антиген відповідає антитілу, то імунний комплекс не утворюється і комплемент залишиться вільним! Комплемент, що залишився вільним, бере участь у другій системі, викликаючи гемоліз, - результат РСК негативний (вміст пробірок прозоро - «лакова кров»).

Компоненти реакції зв'язування комплементу:

Антиген – зазвичай лізат, екстракт, гаптен; рідше завись.

1.Антитело-сироватка хворого система
2. Комплемент – сироватка морських свинок

3. Антиген – еритроцити барана

4. Антитіло - гемолізин до еритроцитів барана

5.Ізотонічний розчин

Зважаючи на те, що в РСК бере участь велика кількість складних компонентів, вони повинні бути попередньо відтитровані і взяті в реакцію в точних кількостях і в рівних обсягах: по 0,5 або 0,25, рідше по 0,2 мл. Відповідно весь досвід проводять у обсягах 2,5, 1,25 або 1,0 мл (великі обсяги дають більш точний результат). Титрування компонентів реакції проводять у тому ж обсязі, в якому ставлять досвід, замінюючи відсутні інгредієнти ізотонічним розчином.

Підготовка інгредієнтів

Гемолітична сироватка (гемолізин). Сироватку розводять 3 рази менше за її титр (див. с. 211). Готують загальне розведення сироватки для всього досвіду, обсяг якого визначають, помноживши об'єм сироватки в одній пробірці (наприклад, 0,5 мл) на число пробірок, що трохи перевищує їх у досвіді.

2. Еритроцити барана. Готують 3% завись відмитих еритроцитів барана (див. с. 211) на всю кількість пробірок у досвіді. Для приготування гемолітичної системи за 30 хв до внесення її в досвід змішують рівні обсяги розведеного гемолізину і суспензії еритроцитів, приливаючи сироватку до еритроцитів, ретельно перемішують і інкубують 30 хв при 37?

3. Комплемент зазвичай розводять 1:10. перед кожним досвідом його обов'язково титрують. Титр комплементу - це його найменша кількість, при додаванні якого до гемолітичної системи відбувається повний гемоліз протягом 1год при 37? Схема титрування комплементу представлена ​​в таблиці 21.

Увага! Титрують комплімент у такому ж обсязі, в якому ставлять основний досвід, замінюючи ізотонічним розчином інгредієнти, що відсутні.

Облік результатів. У контролю не повинно бути навіть слідів гемолізу, тому що в одному з них немає комплементу, в іншому – гемолізину. Контролі свідчать про відсутність у компонентів реакції гемотоксичності (здатність спонтанно лізувати еритроцити).

У наведеному у табл. 21 приклад титр комплементу в розведенні 1:10 дорівнює 0,15 мл. У досвіді активність комплементу може знизитися за рахунок неспецифічної адсорбції його іншими компонентами реакції, тому для досвіду кількість компліменту збільшують: беруть дозу, що наступає за титром. Це – робоча доза. У наведеному прикладі вона дорівнює 0,2 комплементу у розведенні 1:10. Оскільки всі компоненти, що беруть участь у РЗК, повинна бути взята в рівних обсягах (у нашому прикладі він дорівнює 0:5 мл), необхідно до робочої дози комплементу (0,2 мл1:10) додати 0,3 мл ізотонічного розчину. Для всього досвіду об'єм кожного з них (комплементу та ізотонічного розчину).

Для всього досвіду обсяг кожного з них (комплементу та ізотонічного розчину) множать на число пробірок, що беруть участь у РЗК. Наприклад, для проведення досвіду в 50 пробірках потрібно взяти 10 мл комплементу 1:10 (0,2 млх50) та 15 мл ізотонічного розчину (0,3 млх50).

4. Антиген зазвичай одержують готовим із зазначенням його титру, тобто. тієї кількості, яка після розведення антигену повинна міститися в 1 мл. наприклад, при титрі 0,4 його розводять 0,96 мл ізотонічного розчину. У досвід беру кількість антигену, що дорівнює половині титру (0,5 мл). Це його робоча доза. Говорять загальне розведення антигену для всього досвіду, помножуючи 0,5 мл на кількість пробірок у досвіді.

5. Антитіло – сироватка хворого. Свіжу сироватку перед досвідом інактивують, щоб зруйнувати наявний у ній комплемент. Для цього її прогрівають 30 хв при 56С на водяній бані або в інактиваторі з терморегулятором. Останній спосіб кращий: він виключає можливість перегріву сироватки, тобто її денатурації. Денатуровані сироватки не придатні до досвіду. Сироватку хворого зазвичай застосовують у розведенні від 1:10 до 1:160.

Таблиця №14

Імунні сироватки найчастіше готують у виробничих умовах та випускають інактивованими. Їх розводять 1:50 та вище.

Усі компоненти готують із невеликим надлишком.

Таблиця №15

Проведення основного досвіду

При постановці досвіду вкрай; важлива послідовність додавання компонентів. Досвід проводять у дві фази.

Фаза I. У пробірки наливають необхідну кількість ізотонічного розчину натрію хлориду, потім - необхідний об'єм розведеної сироватки і в такому обсязі робочі дози антигену і комплементу. Досвід обов'язково супроводжують контролем усіх інгредієнтів, що беруть участь у ньому: сироватки, антигену, гемолітичної системи та комплементу.

Пробірки ретельно струшують і інкубують при 37°С 45 хв- 1 год або за 4 °С («РСК на холоді») 18 год. За цей час за наявності специфічного комплексу відбувається зв'язування комплементу. Проведення реакції «на холоді» значно підвищує її чутливість та специфічність.

Фаза ІІ. Після закінчення інкубації до всіх пробірок додають по 1 мл гемолітичної системи, яку попередньо витримують у термостаті 30 хв (сенсибілізують). Пробірки струшують і ставлять знову в термостат.

Облік результатів про ст. Пробірки залишають у термостаті до повного гемолізу в 2, 3, 6 і 7 пробірках (контроль сироватки, антигену і комплементу на одну і дві дози). Раніше гемоліз настане в 7-й пробірці, в якій знаходиться подвійна кількість комплементу. Після того, як у цій пробірці відбудеться гемоліз і вміст її стане абсолютно прозорим, потрібно особливо уважно стежити за рештою контролю. Як тільки рідина в 2, 3 і 6-й пробірках стане прозорою, слід негайно вийняти штатив з пробірками з термостата. Про те, що досвід не затримали в термостаті довше, ніж потрібно, говорить наявність легкої каламуті (неповного гемолізу) у 5-й пробірці - в ній знаходиться лише половина робочої дози комплементу та повного гемолізу при правильної постановкидосвіду не може бути.

Гемоліз у контролі сироватки та антигену (пробірки 2 і 3) вказує на те, що їх дози були обрані правильно і що самі по собі ні сироватка, ні антиген комплемент не пов'язують.

У контролі гемолітичної системи (пробірка 4) за її правильній роботіне повинно бути навіть слідів гемолізу – у ній відсутній комплемент.

Переконавшись, що контролі пройшли правильно, можна враховувати досвід. Відсутність гемолізу у пробірках досліду розцінюють як позитивний результат реакції. Він свідчить, що у сироватці є антитіла, специфічні щодо взятого антигену. Утворений ними комплекс пов'язав комплемент і перешкодив його участі реакції гемолізу. Якщо досвідчених пробірках настане гемоліз, результат реакції оцінюють як негативний. В даному випадку немає відповідності між антигеном та антитілом, комплемент не пов'язаний та бере участь у реакції гемолізу.

Паралельно із сироваткою хворого ставлять такий самий досвід із свідомо позитивною сироваткою (тобто із сироваткою, в якій є антитіла до даного антигену) і свідомо негативною, в якій немає специфічних антитіл. При правильній постановці досвіду в першому випадку має бути затримка гемолізу, а в другому буде гемоліз.

Інтенсивність реакції виражають так:

Повна затримка гемолізу. Еритроцити утворюють рівномірну каламут або осідають на дно. В цьому випадку рідина в пробірці стає безбарвною;

Лізовано приблизно 25% еритроцитів. Осад менше, рідина над ним трохи рожева. Результат РЗК також оцінюють як різко позитивний;

Лізовано приблизно 50% еритроцитів. Осад невеликий, рідина рожева. Позитивний результат РЗК;

Лізовано приблизно 75% еритроцитів. Незначний осад, над ним інтенсивно забарвлена ​​рідина. Сумнівний результатРЗК;

Лізовано всі еритроцити. Рідина інтенсивно забарвлена ​​і прозора. Негативний результат РСК.