Кров на рск. Серологічні дослідження крові у діагностиці хвороб

СЕРОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ(Лат. serum сироватка + грецьк. logos вчення) - методи імунології, що вивчають специфічні властивості крові людини або тварин з метою виявлення антигенів або антитіл за допомогою серологічних реакцій.

Початок С. в. покладено наприкінці минулого століття, після того як було встановлено, що з'єднання антигену з антитілом супроводжується рядом доступних візуальному спостереженню феноменів - аглютинацією (див.), преципітацією (див.) або лізисом. З'явилася можливість специфічного розпізнавання антигенів або антитіл, якщо один з цих компонентів відомий.

У 1897 р. Ф. Відаль повідомив, що сироватка крові хворих на черевний тиф вибірково аглютинує черевнотифозні бактерії і тому ця реакція (див. Відаля реакція) може бути застосована для лаб. діагностики черевного тифу У тому ж році було показано, що фільтрати культур чумних, черевнотифозних та холерних бактерій при поєднанні з відповідними імунними сироватками утворюють пластівці або преципітат.

Реакція преципітації виявилася придатною виявлення будь-яких білкових антигенів. У 1900-1901 pp. К. Ландштейнер виявив, що в еритроцитах людей є два різні антигени (А і В), а в сироватках крові два аглютиніни (а і Р), що сприяло застосуванню реакції гемаглютинації для визначення груп крові (див.).

Реакція аглютинації для визначення групи крові та резус-фактора застосовується в акушерській практиці, при гемотрансфузіях та трансплантації тканин. Антитіла проти резус-фактора (див.) є неповними антитілами, вони не здатні до прямої реакції з резус-позитивними еритроцитами, тому для їх виявлення використовують реакцію Кумбса (див. Кумбса реакція), засновану на виявленні неповних антитіл за допомогою антиглобулінових сироваток. До еритроцитів відомої специфічності додають досліджувану сироватку крові, а потім антиглобулінову сироватку проти IgG (непряма реакція Кумбса). Fab-фрагменти неповних антитіл досліджуваної сироватки крові приєднуються до еритроцитів, а до вільних Fc-фрагментів цих антитіл приєднуються антитіла проти IgG, і відбувається аглютинація еритроцитів. Для діагностики гемолітичної анемії використовують пряму реакцію Кумбса. В організмі таких хворих еритроцити з'єднуються з циркулюючими в крові антитілами проти резус-фактора. Щоб їх виявити, до еритроцитів, взятих у хворого, додають антитіла проти IgG. Поява аглютинації еритроцитів підтверджує діагноз хвороби.

Реакція гальмування гемаглютинації – РТГА (див. Гемаглютинація) – заснована на феномені запобігання (гальмуванні) імунною сироваткою гемаглютинації еритроцитів вірусами. Феномен вірусної гемаглютинації не є серол. реакцією і відбувається в результаті з'єднання вірусу з рецепторами еритроцитів, проте РТГА є серологічною реакцією, яка використовується для виявлення та титрування противірусних антитіл. РТГА - основний метод серодіагностики грипу, кору, краснухи, епідемічного паротиту, кліщового енцефаліту та інших вірусних інфекцій, збудники яких володіють гемагглютинуючими властивостями.

Реакція пасивної, або непрямої, гемагглютинацій, В ній використовують еритроцити або нейтральні синтетичні хчатеріали (напр., частинки латексу), на поверхні яких сорбовані антигени (бактеріальні, вірусні, тканинні) або антитіла (див. Бойдена реакція). Аглютинація їх відбувається при додаванні відповідних сироваток або антигенів. Еритроцити, сенсибілізовані антигенами, називають антигенним еритроцитарним діагностикумом і використовують для виявлення та титрування антитіл. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами, називають імуноглобуліновими еритроцитарними діагностикумами (див.) і використовують для виявлення антигенів:

Реакція пасивної гемаглютинації застосовується для діагностики захворювань, спричинених бактеріями (черевний тиф та паратифи, дизентерія, бруцельоз, чума, холера та ін.), найпростішими (малярія) та вірусами (грип, аденовірусні інфекції, кліщовий енметрадіт). . Реакція пасивної гемаглютинації за чутливістю не поступається методу виділення вірусу при ареновірусних хворобах, зокрема при лімфоцитарному хоріоменінгіті. Вірусний антиген лімфоцитарного хоріоменінгіту виявляється у вірусоносіїв (будинкових мишей) у реакції пасивної гемаглютинації з суспензіями вилучених органів, розведеними в десятки тисяч разів. При сальмонельозі реакції пасивної гемагглютинації визначаються бактерії при концентрації до кількох сотень мікробних тіл в 1 г фекалій, дизентерійні бактерії в харчових продуктах виявляються при вмісті в 1 г матеріалу не менше 500 мікробних тіл.

Реакція пасивної гемаглютинації використовується в діагностиці та профілактиці вірусного гепатиту В. У Радянському Союзі для виявлення HBs-антигена (див. Австралійський антиген) в крові хворих з гострим гепатитом В проводиться діагностикум, що являє собою еритроцити курей, сенсибілізовані козиним H. Краплю діагностикуму з'єднують з рівним об'ємом сироватки крові обстежуваних людей, і, якщо в ній є HBs-антиген, відбувається аглютинація. Реакція здатна вловити до 1,5 нг/мл HBs-антигену. Для виявлення HBs-антитіл використовують еритроцити з сорбованим на них HBs-антигеном, виділеним із крові хворих. Реакцію пасивної гемаглютинації застосовують також для виявлення підвищеної чутливості хворого до лікарським препаратамі гормонів, наприклад, пеніциліну або інсуліну. У цьому випадку еритроцити групи крові людини сенсибілізують лікарською речовиною і потім використовують для виявлення до неї аглютинінів у сироватці крові хворого.

Реакцію пасивної гемаглютинації використовують виявлення гонадотропного гормону в сечі з метою встановлення вагітності (див. Хоріонічний гонадотропін). Для цього стандартна сироваткадо цього гормону інкубується з сечею, що досліджується. При подальшому додаванні еритроцитів з сорбованим на них гормоном аглютинація не настає (позитивна відповідь), тому що гормон, що міститься в сечі, нейтралізував аглютинуючі антитіла.

Реакції, засновані на феномен преципітації

Їх використовують для визначення найрізноманітніших антигенів та антитіл. Найпростішим прикладом якісної реакції є утворення непрозорої смуги преципітації на межі нашарування антигену антитіло в пробірці. Широко застосовуються різні різновиди реакції преципітації в напіврідких гелях агару або агарози (метод подвійної імунодифузії по Оухтерлоню, метод радіальної імунодифузії, імуноелектрофорез), які носять одночасно якісний і кількісний характер (див. Імунодифузія ).

Для встановлення подвійної імунодифузії наливають шар розтопленого гелю на скляну пластинку і після затвердіння вирізають лунки діаметром 1,5-3 мм. У розташовані по колу лунки поміщають досліджувані антигени, а центральну лунку - імунну сироватку відомої специфічності. Дифузуючи назустріч один одному, гомологічні сироватки та антигени утворюють преципітат. При радіальній імунодифузії (за методом Манчіні) імунну сироватку вносять у агар. Антиген, поміщений в лунки, дифундує через агар, і в результаті преципітації з імунною сироваткою навколо лунок утворюються непрозорі кільця, зовнішній діаметр яких пропорційний концентрації антигену. Модифікацію цієї реакції використовують у діагностиці грипу для розпізнавання IgM- та IgG-антитіл (див. Імуноглобуліни). До агару вносять грипозний антиген, а до лунок сироватки крові. Потім пластини обробляють імунними сироватками проти IgM або IgG-антитіл, що сприяє виявленню реакції відповідних антитіл з антигенами. Метод дозволяє одночасно визначати титри антитіл та належність їх до певного класу імуноглобулінів.

Різновидом імуноелектрофорезу є радіоімунофорез. У цьому випадку після електрофоретичного поділу антигенів у канавку, вирізану паралельно руху антигенів у гелі, наливають спочатку мічену радіоактивним йодомімунну сироватку проти визначених антигенів, а потім імунну сироватку проти IgG-антитіл, яка преципітує утворилися комплекси антитіла з антигеном. Реагенти, що не зв'язалися, вимивають, а комплекс антиген - антитіло виявляють методом авторадіографії (див.).

Реакції за участю комплементу. Реакції за участю комплементу засновані на здатності субкомпонента комплементу Cl(Clq) і потім інших компонентів комплементу приєднуватися до імунних комплексів.

Реакція зв'язування комплементу дозволяє титрувати антигени або антитіла за ступенем фіксації комплементу комплексом антиген антитіло. Ця реакція складається з двох фаз: взаємодії антигену з випробуваною сироваткою крові (досліджувана система) та взаємодії гемолітичної сироватки з баранячими еритроцитами (індикаторна система). При позитивної реакціїу досліджуваній системі відбувається зв'язування комплементу, і тоді при додаванні сенсибілізованих антитілами еритроцитів немає гемолізу (див. Реакція зв'язування комплементу). Реакція широко застосовується для серодіагностики вісцерального сифілісу (див. Вассермана реакція) та вірусних інфекцій (див. Вірусологічні дослідження).

цитоліз. Антитіла проти клітинних структур можуть за участю комплементу розчиняти клітини, що несуть ці структури. Лізис еритроцитів легко оцінювати за ступенем та інтенсивністю звільнення гемоглобіну. Лізу нуклеарних клітин оцінюють шляхом підрахунку відсотка мертвих клітин, які не забарвлюються метиленовим синім. Часто також використовують радіоактивний хром, який попередньо хімічно пов'язують з клітинами. Число зруйнованих клітин визначають за кількістю незв'язаного хрому, що звільняється при лізисі клітин.

Реакція радіального гемолізу еритроцитів може протікати гелі. Завис еритроцитів барана поміщають в агарозний гель, додавши туди комплемент; у застиглому на склі шарі роблять лунки і вносять у них гемолітичну сироватку. Навколо лунок у результаті радіальної дифузії антитіл утворюватиметься зона гемолізу. Радіус зони гемолізу прямо пропорційний титру сироватки. Якщо сорбувати на еритроцитах будь-який антиген, напр, глікопротеїновий гемаглютинін вірусу грипу, краснухи або кліщового енцефаліту, можна відтворити феномен гемолізу імунними сироватками до цих вірусів. Реакція радіального гемолізу в гелі знайшла застосування в діагностиці вірусних інфекцій завдяки простоті постановки, нечутливості до сироваткових інгібіторів, можливості титрувати сироватки крові по діаметру зони гемолізу, не вдаючись до серійних розведень.

Імунне прилипання. Еритроцити, тромбоцити та інші клітини крові мають на поверхні рецептори до третього компоненту комплементу (C3). Якщо до антигену (бактерії, віруси та ін.) додати відповідну імунну сироватку та комплемент, то утворюється комплекс антиген - антитіло, покритий C3-компонентом комплементу. При змішуванні з тромбоцитами завдяки C3-компоненту комплементу комплекс антиген - антитіло осяде на клітинах і викличе їхню аглютинацію (див. Імунне прилипання). Ця реакція застосовується для визначення антигенів системи HLA (див. трансплантаційний імунітет) і при вивченні ряду вірусних інфекцій(кліщовий енцефаліт, лихоманка денге), які супроводжуються імунопатол. процесами та циркуляцією в крові вірусних антигенів у комплексі з антитілами.

Реакція нейтралізації заснована на здатності антитіл нейтралізувати деякі специфічні функції макромолекулярних або розчинних антигенів, напр, активність ферментів, токсини бактерій, хвороботворність вірусів. У бактеріології ця реакція використовується для виявлення антистрептолізинів, антистрептокінази та антистафілолізинів. Реакцію нейтралізації токсинів можна оцінювати за біол. ефекту, так, напр., титрують антиправцеві та антиботулінічні сироватки (див. Токсин - антитоксин реакція). Суміш токсину з антисироваткою, введена тваринам, запобігає їх загибелі. Різні варіантиРеакцію нейтралізації застосовують у вірусології. При змішуванні вірусів з відповідною антисироваткою та введенні цієї суміші тваринам або клітинні культури патогенність вірусів нейтралізується.

Реакції з використанням хімічних та фізичних міток

Імунофлюоресценція, розроблена Кунсом (А. Н. Coons) у 1942 р., полягає у використанні для серол. реакцій мічених флюорохромом сироваток (див. Імунофлюоресценція). Мічена флюорохромом сироватка утворює з антигеном комплекс антиген - антитіло, який стає доступним спостереженню під мікроскопом в ультрафіолетових променях, що збуджують світіння флюорохрому. Реакцію прямої імунофлюоресценції використовують для вивчення клітинних антигенів, виявлення вірусу в заражених клітинах та виявлення бактерій та рикетсій у мазках. Так, для діагностики сказу відбитки шматочків мозку тварин, підозрюваних на вірусоносійство, обробляють люмінесцентною антирабічною сироваткою. При позитивному результаті протоплазмі нервових клітин спостерігаються глибки яскраво-зеленого кольору. На виявленні антигенів вірусів у клітинах відбитків зі слизової оболонки носа заснована експрес-діагностика грипу, парагрипу та аденовірусної інфекції.

Ширше застосовується метод непрямої імунофлюоресценції, заснований на виявленні комплексу антиген - антитіло за допомогою люмінесцентної імунної сироватки проти IgG-антитіл і використовуваний для виявлення не тільки антигенів, але і титрування антитіл. Метод знайшов застосування у серодіагностиці герпесу, цитомегаліп, лихоманки Ласса. У лабораторії повинен зберігатися при г°-20° запас препаратів антигенсодержащих клітин, напр, вирощені на шматочках тонкого скла і заражені вірусом клітини VERO або курячі фібробласти, зафіксовані ацетоном. На препарати нашаровують досліджувану сироватку крові, поміщають препарат у термостат при f 37° для утворення імунних комплексів, а потім після відмивання реагентів, що не зв'язалися, виявляють ці комплекси міченою люмінесцентною сироваткою проти глобулінів людини. Застосовуючи мічені імунні сироватки проти IgM або IgG-антитіл, можна диференціювати тип антитіл і виявляти ранню імунну відповідь за наявності IgM-антитіл.

В ензим – імунологічному методі застосовують антитіла, кон'юговані з ферментами, гол. обр. пероксидазою хрону або лужною фосфатазою. Щоб виявити з'єднання міченої сироватки з антигеном, додають субстрат, що розкладається приєднаним до сироватці ферментом з появою фарбування жовто-коричневий (пероксидаза) або жовто-зелений (фосфатаза) колір. Використовують також ферменти, які розкладають як хромогенний, а й люмогенный субстрат. В цьому випадку при позитивній реакції утворюється свічення. Подібно до імунофлюоресценції, ензимімунологічний метод застосовують для виявлення антигенів у клітинах або титрування антитіл на антигенсодержащих клітинах.

Найбільш популярним різновидом ензим-імунологічного методу є імуносорбція. На твердому носії, яким можуть бути целюлоза, поліакриламід, декстран і різні пластмаси, сорбують антиген. Найчастіше носієм є поверхня лунок мікропанелей. У лунки з сорбованим антигеном вносять досліджувану сироватку крові, потім мічену ферментом антисироватку та субстрат. Позитивні результати враховують зміни кольору рідкого середовища. Для виявлення антигенів на носій сорбують антитіла, потім вносять до лунок досліджуваний матеріал і виявляють реакцію міченою ферментом антимікробною сироваткою.

Радіоімунологічний метод заснований на застосуванні радіоізотопної мітки антигенів або антитіл. Спочатку він був розроблений як специфічний метод вимірювання рівня циркулюючих у крові гормонів. Тест-системою був мічений ізотопом гормон (антиген) та антисироватка до нього. Якщо до такої антисироватки додати матеріал, що містить шуканий гормон, він зв'яже частину антитіл, при подальшому внесенні міченого титрованого гормону з антитілами зв'яжеться зменшена в порівнянні з контролем його кількість. Результат оцінюють у порівнянні кривих зв'язаної і незв'язаної радіоактивної мітки. Цей різновид методу носить назву конкурентної реакції. Існують інші модифікації радіоімунологічного методу. Радіоімунологічний метод - найбільш чутливий метод визначення антигенів та антитіл, що використовується для визначення гормонів, лікарських речовинта антибіотиків, для діагностики бактеріальних, вірусних, рикетсіозних, протозойних захворювань, дослідження білків крові, тканинних антигенів.

Порівняльна характеристика та використання методів серологічних досліджень у медичній практиці

Методи С. в. безперервно удосконалюються у напрямі підвищення чутливості та універсальності використання. Спочатку серол. діагностика ґрунтувалася на виявленні антитіл. З появою у середині 20 в. реакцій імунофлюоресценції та пасивної гемагглютинації, що мають більшу чутливість, з'явилася можливість виявляти не тільки антитіла, а й антиген безпосередньо в матеріалі від хворих. Ензим-імунологічний та радіоімунологічний методи, що за чутливістю на 2-3 порядки перевищують імунофлюоресценцію та пасивну гемаглютинацію, наближаються до методів біол. виявлення бактерій та вірусів. Область їх застосування виявлення як антигенів, і антитіл теоретично не обмежена.

Серодіагностика інф. хвороб базується на появі антитіл до виділеного або передбачуваного збудника незалежно від того, чи був виявлений збудник у гострій стадії хвороби. Досліджують пари сироваток крові, взятих на початку хвороби та 2-3 тижні. по тому. Приріст антитіл у другій сироватці крові не менше ніж у 4 рази порівняно з першою є діагностично значущим. Має також значення, яким класом імуноглобулінів є антитіла. IgM-антитіла виявляють в кінці гострого періоду хвороби та в ранній стадіїреконвалесценції. IgG-антитіла з'являються в більш пізні терміни реконвалесценції і довго циркулюють. Якщо у жінки в першому триместрі вагітності виявляють IgM-антитіла до вірусу краснухи, то це є підставою для переривання вагітності, тому що в цей період плід особливо чутливий до вірусу. За різних інф. хворобах вибірково використовують найбільш специфічні та зручні у виконанні методи.

С. в. широко застосовують у епідеміології. Систематичний збір та вивчення зразків крові різних груп населення дозволяють усвідомити контакти населення з джерелом збудників інф. хвороб. Вивчення рівня колективного імунітету дозволяє виявляти групи підвищеного ризику та планувати заходи для щеплення, вивчати географічне поширення інфекцій. С. в. різних вікових груп населення дозволили, наприклад, ретроспективно виявити циркуляцію різних варіантів вірусу грипу у певні періоди часу.

С. в. мають велике значення у вивченні спадкових хвороб (див.) та аутоімунних хвороб, що супроводжуються появою тканинно- та органоспецифічних антитіл, що руйнують відповідні клітини-мішені, а також в онкології для виявлення пухлинних антигенів. Так, імунодіагностика раку печінки заснована на визначенні у сироватці крові хворих на альфа-фетопротеїн та інші ембріональні антигени методом імунодифузії та радіоімунологічним методом.

Значний прогрес науки у вивченні тонкої антигенної структури клітинних антигенів, антигенів бактерій та вірусів досягається завдяки застосуванню серолу. реакціях моноклональних антитіл, які можна отримувати до окремих детермінантів антигену.

Бібліографія:Методи досліджень в імунології, за ред. І. Лефковітса та Б. Перніса, пров. з англ., М., 1981; Посібник з імунології, під ред. О. Є. В'язова та Ш. X. Ходжаєва, М., 1973; Посібник з клінічної лабораторної діагностики, під ред. Ст Ст Меньшикова, М., 1982; Immunology, ed. by J.-F. Bach, N. Y., 1978.

С. Я. Гайдамович.

Що таке серологічні дослідження, навіщо вони проводяться, які основні методи серологічної діагностики?

Серологічні дослідження - це методи вивчення антигенів або антитіл у біологічному матеріалі хворих, що ґрунтуються на певних реакціях імунітету. Виявлення в біологічному матеріалі антитіл до збудника інфекції чи антигенів дозволяє встановити причину захворювання.

не мають 100% специфічності та чутливості при діагностиці інфекційних захворювань. Тому оцінювати їх результати необхідно з урахуванням клінічної картини захворювання. Цим обумовлена ​​необхідність використання для діагностики інфекції кількох тестів, а також застосування методів Western-blot, що підтверджують результати скринінгових методів

«Імуноблот (Вестерн-блот, Western-blot) є фактично кінцевим верифікаційним (підтверджуючим) методом у ланцюзі імунологічних досліджень, які дозволяють зробити остаточний лабораторний висновок. Особливо важливий цей тест для підтвердження або спростування інфекційного захворювання (наприклад, кашлющ, бореліоз тощо). Метод Вестрен-блоту, зазвичай, необхідний після виявлення позитивних антитіл класу IgG інфекційного процесу, т.к. саме в такій комбінації відбувається більш правильна лабораторна інтерпретація результатів та подальша тактика лікування пацієнта. Для постановки Вестерн-блоту використовують спеціальні нітроцелюлозні смужки, на які методом горизонтального і вертикального імунофорезу перенесені білки в порядку наростання молекулярної ваги. Антитіла сироватки пацієнта взаємодіє з білками у певних зонах смужки, а далі відбувається перебіг реакції аналогічний імуноферметному аналізу (ІФА)»,- пояснює к.мед.наук, медичний директор лабораторії СІНЕВО Україна, Оксана Владиславівна Небильцова.

Біологічний матеріал, що використовується для серологічного дослідження

• Сироватка крові
• Слина
• Фекальні маси

Для діагностики яких станів використовуються серологічні дослідження

Метою серологічних досліджень є встановлення ефективності проведеного лікування після одужання пацієнта, а також виявлення рецидиву захворювання. Крім того, серологічні методи можуть виявити такі захворювання як:

• Амебіаз
• Лямбліоз
• Описторгосп
• Трихінельоз
• Токсокароз
• Цистицеркоз
• Ехінококоз

Основні методи, що використовуються в серологічній діагностиці

Реакція імунофлюоресценції (РІФ, метод Кунса)

Різновиди методу:

Прямий: мікроби або антигени тканин або мікроби обробляються спеціальними сироватками з антитілами, а також міченими флюорохромами, що світяться в УФ-променях. Бактерії, таким чином, світяться у вигляді облямівки зеленого кольору по периферії клітини. Спостерігається у люмінісцентному мікроскопі.

Непрямий: мазки обробляються антитілами антимікробної кролячої сироватки. Потім антитіла, які не зв'язалися з антигенами бактерій, відмиваються. Таким чином, виявляються антитіла, що залишилися на мікробах. У результаті, утворюється комплекс мікроб + антикролячі антитіла + антимікробні кролячі антитіла, позначені флюорохромом. Цей комплекс спостерігається у люмінесцентному мікроскопі.

Для оцінки результатів існує чотирибальна шкала, яка характеризується інтенсивністю поверхневого жовто-зеленого свічення клітин антигенів:

Дуже слабке свічення клітини

Слабке світіння периферії клітини

+++/++++ яскраве свічення клітини

Титром реакції вважається розведення сироватки з результатом результату реакції +++ або ++++.

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГ)

Реакція пасивної або непрямої гемаглютинації використовується при діагностики інфекцій, викликаних найпростішими, бактеріями та рикетсіями.

Методика складається з кількох етапів. Спочатку еритроцити обробляються «відмиваються» ізотонічним розчином хлориду натрію, після, за необхідності, - розчином таніну 1: 20000, потім сенсибілізуються розчинними антигенами. Після обробки буферним ізотонічним розчином натрію хлориду, антиген готовий до вживання. Сироватку розводять у пробірках ізотонічним розчином натрію хлориду, після чого до кожної розведеної сироватці додають еритроцитарний діагностикум.

Результати оцінюють характером осаду еритроцитів:

Слабка інтенсивність

Середня інтенсивність

Інтенсивна реакція

Різко інтенсивна реакція

Позитивним вважається результат реакції з інтенсивною реакцією +++ або різко інтенсивною реакцією ++++, у яких еритроцити покривають все дно пробірки.

Імуноферментний аналіз (ІФА)

Метод має високу специфічність і чутливість, більше 90%. Основна перевага - можливість виявлення інфекціїі простеження динаміки процесу, який вказує рівень антитіл.

Застосовується аналіз для діагностики широкого кола інфекцій, у тому числі:

• Віч інфекція
• Вірусні гепатити
• Цитомегаловірусна інфекція
• Герпесна інфекція
• Токсоплазмова інфекція

Нові рекомендації щодо здорового харчування за результатами нового дослідження

Антиген або антитіло фіксується на твердих планшетах, потім за допомогою ферментної мітки виявляються комплекси антиген - антитіло.

ІФА має ряд переваг перед рештою серологічних методів. Реакція найбільш чутлива, а тестах використовуються універсальні реагенти. Аналіз відрізняється швидкістю, можливістю дослідження імуноглобулінів різних класів. В даний час ІФА є одним з основних методів лабораторної діагностики.

Оцінка результатів ІФА здійснюється автоматично за допомогою спеціальних приладів. У деяких випадках також допускається візуальний облік результатів реакції. Достовірність серологічної діагностики залежить від організації лабораторного контролю, що з кількох процедур, виділені на оцінки якості результатів.

Реакція зв'язування комплементу (РСК) ставиться у дві фази: у першій фазі антиген з'єднують з досліджуваною сироваткою, в якій припускають наявність антитіл і додають комплемент, інкубують термостаті 30 хвилин.

Друга фаза: додають гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка). Після інкубації термостаті протягом 30 хвилин враховують результат.

При позитивній РЗК антитіла сироватки, з'єднавшись з антигеном, утворюють імунний комплекс, який приєднує до себе комплемент, і гемолізу не відбудеться. Якщо реакція негативна (антитіл у досліджуваної сироватки немає) – комплемент залишиться вільним і станеться гемоліз.

РСК застосовується для серологічної діагностики сифілісу, гонореї, висипного тифута інших захворювань.

Реакції імунітету з використанням мічених антигенів і антитіл засновані на тому, що один з інгредієнтів, що беруть участь у реакції (антигени або антитіла), з'єднують з якоюсь міткою, яку легко можна виявити. Як мітки використовують флюорохроми (РІФ), ферменти (ІФА), радіоізотопи (РІА), електрооплотні сполуки (ІЕМ).

Імуноферментний аналіз (ІФА), як і інші реакції імунітету, використовується: 1) для визначення невідомого антигену за допомогою відомих антитіл або 2) для виявлення антитіл у сироватці за допомогою відомого антигену. Особливість реакції в тому, що відомий інгредієнт реакції з'єднаний із ферментом (наприклад, пероксидазою). Присутність ферменту визначають за допомогою субстрату, що при дії ферменту забарвлюється. Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА.

1) Виявлення антигену. Перший етап - адсорбція специфічних антитіл на твердій фазі, як яку використовують полістиролові або полівінілхлоридні поверхні лунок пластикових панелей. Другий етап – додавання досліджуваного матеріалу, в якому передбачається наявність антигену. Антиген зв'язується із антитілами. Після цього лунки промивають. Третій етап - додавання специфічної сироватки, що містить антитіла проти даного антигену, мічені ферментом. Мічені антитіла приєднуються до антигенів, які надлишок видаляється промиванням. Таким чином, якщо досліджуваний матеріал має антигени, на поверхні твердої фази утворюється комплекс антитіла - антиген - антитіла, мічені ферментом. Для виявлення ферменту додають субстрат. Для пероксидази субстратом служить ортофенілендіамін у суміші з Н 2 Про 2 у буферному розчині. Під дією ферменту утворюються продукти, що мають коричневе забарвлення.

2) Виявлення антитіл. Перший етап – адсорбція специфічних антигенів на стінках лунок. Зазвичай у комерційних тест-системах антигени вже адсорбовані на поверхні лунок. Другий етап – додавання досліджуваної сироватки. За наявності антитіл утворюється комплекс антиген-антитіло. Третій етап – після відмивання у лунки додають антиглобулінові антитіла (антитіла проти людських глобулінів), мічені ферментом. Результати реакції оцінюють, як зазначено вище.

Як контроль використовують зразки свідомо позитивні і свідомо негативні, які є в комерційних системах.

ІФА застосовується для діагностики багатьох інфекційних захворювань, зокрема ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів.

Імуноблот - це різновид ІФА (поєднання електрофорезу та ІФА). Методом електрофорезу в гелі поділяють біополімери, наприклад антигени вірусу імунодефіциту людини. Потім переносять розділені молекули на поверхню нітроцелюлози в тому ж порядку, як вони знаходилися в гелі. Процес перенесення називається блот, а отриманий відбиток - блот (англ. blot - пляма). Цей відбиток діють досліджуваної сироваткою. Потім додають сироватку проти глобулінів людини, мічену пероксидазою, потім субстрат, який під дією ферменту набуває коричневого кольору. Утворюються коричневі смуги тих місцях, де антитіла з'єдналися з антигенами. Метод дозволяє виявити антитіла до окремих антигенів вірусу.

Радіоімунний аналіз (РІА). Метод дозволяє визначити кількість антигену в досліджуваній пробі. Спочатку до імунної сироватці приєднують матеріал, ймовірно містить антиген, потім відомий антиген, мічений радіоізотопом, наприклад I 125 . В результаті відбувається зв'язування визначеного (німецького) та відомого міченого антигену з обмеженою кількістю антитіл. Оскільки мічений антиген додається у певній дозі, то можна визначити, яка його частина зв'язалася з антитілами, а яка залишилася вільною через конкуренцію з неміченим антигеном і була видалена. Кількість міченого антигену, що зв'язався з антитілами, визначають за допомогою лічильника. Воно обернено пропорційно кількості визначеного антигену.

Імуноелектронна мікроскопія (ІЕМ). До антигену, наприклад, до вірусу грипу, приєднується специфічна антисироватка, мічена електроноплотною речовиною. Як мітки застосовують металовмісні білки (феритин, гемоціанін) або колоїдне золото. При мікроскопії в електронному мікроскопіроблять фотографії, на яких видно віріони грипу з темними точками, що приєдналися до них - молекулами мічених антитіл.

Контрольні питання

Набутий імунітет, відмінність його від спадкового (видового, вродженого). Види набутого імунітету.

Завдання.У сім'ї захворіла на дифтерію дитина Валерій, трьох років. Інші члени сім'ї не захворіли, причому мати перехворіла на дифтерію в дитинстві, а батько був щеплений дифтерійним анатоксином. Старша сестра Наташа, п'яти років, свого часу не була щеплена дифтерійним анатоксином через медичні протипоказання, тому довелося провести їй екстрену профілактику за допомогою протидифтерійної антитоксичної сироватки. Молодший брат, Віталій, трьох місяців не захворів, хоча нічим не був щеплений. У будинку є кішка та собака, вони не захворіли. Назвіть для кожного з членів сім'ї та для тварин вид імунітету, завдяки якому вони не захворіли.

Що таке антиген? Які речовини можуть бути антигенами? Повноцінні антигени та гаптени, чим вони відрізняються один від одного? Структура антигену. Як називається частина молекули антигену, що визначає його специфічність? Назвіть відомі вам антигени. Що таке аутоантигени? Антигенна будова мікробної клітини. Жгутикові та соматичні антигени; локалізація, буквене позначення, хімічна природа, відношення до температури, спосіб отримання, практичне застосування. Анатоксин, його властивості, застосування, одержання. Яка тканина становить імунну систему? Вкажіть центральні та периферичні органи імунної системилюдини. Опишіть процес формування гуморальної та клітинної імунної відповіді. Вкажіть клітини, які здійснюють захоплення та перетравлення антигену; клітини, що взаємодіють при формуванні гуморального імунітету, клітинного імунітету; клітини, які трансформуються та перетворюються на плазмоцити, що продукують антитіла; клітини, що стимулюють цей процес; клітини, які пригнічують імунну відповідь; клітини, які вбивають пухлинні клітини, та заражені вірусом клітини. Що таке антитіла? Як отримати імунну сироватку? Як отримати сироватку, яка б нейтралізувала правцевий токсин? Проти яких антигенів утворюються антитоксини, аглютиніни, гемолізини? Які антитіла утворюються під час введення в організм дифтерійного анатоксину? дифтерійних бактерій? Хімічна природа та структура антитіл. Що таке активний центр імуноглобуліну? Перерахуйте класи імуноглобулінів, їх властивості. Вкажіть клас імуноглобулінів, здатних проникати крізь плаценту. До якого класу належать секреторні імуноглобуліни? Динаміка накопичення антитіл. Чим відрізняється вторинна імунна відповідь від первинної? Як у практичній медицині використовуються знання про динаміку імунної відповіді? Що таке реакції імунітету, який їхній механізм, фази реакції. У яких 2 напрямках використовують реакції імунітету? Перерахуйте реакції імунітету.

Завдання.Поставте замість пропущених слів «анатоксин» або «антитоксин»: _________ є антигеном, _________ є антитілом, __________ створює при введенні в організм активний імунітет, __________ створює при введенні в організм пасивний імунітет, __________ отримують шляхом імунізації тварин, __________ отримують з токси формаліном та теплом, ___________ нейтралізує токсини, __________ викликає в організмі утворення антитіл.

Реакція аглютинації: що таке аглютинація, що є антигеном, що – антитілом; способи постановки, які контролі ставляться і навіщо; як мають виглядати контролі. Аглютинуючі сироватки, що вони містять, як їх отримують, для чого застосовуються; що таке титр аглютинуючої сироватки? Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації: що служить антигеном у цій реакції, як його одержують, механізм реакції. Що таке еритроцитарний діагностикум? Що таке античний еритроцитарний діагностикум? Реакції преципітації: що таке преципітація, що є антигеном; як отримати сироватку, що преципітує? Що таке титр преципітуючої сироватки? Методи постановки, практичне застосування.

Реакція зв'язування комплементу (РЗК): принцип РЗК; що утворюється при взаємодії імунної сироватки з специфічним антигеном; що відбувається з комплементом, якщо він є при цьому взаємодії? Яка доля комплементу у тому випадку, якщо між антигеном та антитілами немає специфічної спорідненості? Якщо кінцевим результатом РСК є гемоліз, що це означає – позитивний чи негативний результат? Методика постановки РЗК. Чому досліджувану сироватку треба інактивувати? Гемолітична сироватка: що містить, як її одержують, що таке титр і як його визначають? Комплемент: хімічна природа, ставлення до високій температурі, де міститься? Як можна зруйнувати комплемент? Що практично застосовується як комплемент?

Завдання.На одязі людини, звинуваченої у вбивстві, виявлено пляму крові. За допомогою якої реакції можна визначити, чи це людська кров; що в цій реакції буде антигеном і що антитілами; який діагностичний препарат потрібно мати у лабораторії для цієї реакції, як його готують?

Завдання.Як за допомогою реакції преципітації визначити, чи доставлений для аналізу зразок м'яса великої рогатої худоби або м'яса коня; які необхідні діагностичні препарати?

Реакція преципітації в агаровому гелі, способи постановки, практичне застосування.

Серологічний метод дослідження.

Реакції антиген-антитіло

Особливості взаємодії антитіла з антигеном є основою діагностичних реакцій у лабораторіях.

Реакція in vitro між антигеном та антитілом складається з:

специфічною

неспецифічної фази.

У спеціфічну фазу відбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла із детермінантою антигену.

Потім настає неспецифічна фаза - повільніша, яка проявляється видимими фізичними явищаминаприклад, утворенням пластівців (феномен аглютинації) або преципітату у вигляді помутніння. Ця фаза потребує певних умов (електролітів, оптимального рН середовища).

З цією метою застосовують серологічні методи (Від лат. serum - сироватка та logos - вчення), тобто методи вивчення антитіл та антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються в сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму.

При виділенні мікроба від хворого проводять ідентифікацію збудника шляхом вивчення його антигенних властивостей за допомогою імунних діагностичних сироваток, тобто сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це так звана серологічнаідентифікація мікроорганізмів.

Реакції аглютинації

Реакція аглютинації- РА(Від лат. agglutinatio - склеювання) - проста постановка реакція, при якій відбувається зв'язування антитілами корпускулярних антигенів (бактерій, еритроцитів або інших клітин, нерозчинних частинок з адсорбованими на них антигенами, а також макромолекулярних агрегатів). Вона протікає за наявності електролітів, наприклад, при додаванні ізотонічного розчину натрію хлориду.

Застосовуються різні варіанти реакціїаглютинації:

розгорнута,

орієнтовна,

непряма та ін.

Реакція аглютинації проявляється утворенням пластівцівабо осаду (клітини, «склеєні» антитілами, що мають два або більше антигензв'язуючих центрів).

Ра використовують для:

1) визначення антитіл у сироватці крові більнихнаприклад, при бруцельозі (реакції Райта, Хеддельсона), черевному тифі та паратифах (реакція Відаля) та інших інфекційних хворобах;

визначення збудника , виділеного від хворого;

визначення груп крові з використанням моноклональних антитіл проти алло-антигенів еритроцитів.

Для визначення у хворого антитіл ставлятьрозгорнуту реакцію аглютинації: до розведення сироватки крові хворого додають діагностикум(завись вбитих мікробів,) і за кілька годин інкубації при 37 °З відзначають найбільше розведення сироватки (титр сироватки), у якому відбулася аглютинація, т. е. утворився осад.

Характер і швидкість аглютинації залежить від виду антигену і антитіл. Прикладом є особливості взаємодії діагностикумів (О та К-антигенів) зі специфічними антитілами. Реакція аглютинації з О-діагностикумом(бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли термостабільний О-антиген)відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації. Реакція аглютинації з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли термолабільний джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.

Якщо потрібно визначити збудник, виділений від хворого, ставлять орієнтиро очну реакцію аглютинації, застосовуючи діагностичні антитіла (аглютинуючу сироватку), тобто проводять серотипування збудника. Орієнтовну реакцію проводять на предметному склі. До краплі діагностичної аглютинуючої сироватки у розведенні 1:10 або 1:20 додають чисту культуру збудника, виділеного від хворого. Поруч ставлять контроль: замість сироватки наносять краплю розчину хлориду натрію. При появі в краплі із сироваткою та мікробами пластівеподібного осаду ставлять розгорнуту реакцію аглютинації в пробірках з розведеннями, що збільшуються, агглютинирующей сироватки, до яких додають по 2-3 краплі суспензії збудника. Аглютинацію враховують за кількістю осаду та ступенем просвітлення рідини. Реакцію вважаютьпозитивною, якщо аглютинація відзначається у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки. Одночасно враховують контролі: сироватка, розведена ізотонічним розчином хлориду натрію, повинна бути прозорою, завись мікробів в тому ж розчині - рівномірно каламутною, без осаду.

Різні споріднені бактерії можуть аглютинуватися однією і тією ж діагностичною аглютинуючою сироваткою, що ускладнює їх ідентифікацію. Тому користуються адсорбованими аглютинуючими сиворотами,з яких видалені перехреснореагуючі антитіла шляхом адсорбції їх родинними бактеріями. У таких сироватках зберігаються антитіла, специфічні лише до цієї бактерії. Отримання таким способом монорецепторних діагностичних аглютинуючих сироваток було запропоновано А. Кастеляні (1902).

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНДА, РПДА)заснована на використанані еритроцитів(або латексу) з адсорбірованними на їх поверхні антигенами абоантитілами, взаємодія яких з відповідними антитіламиабо антигенами сироватки крові хворих викликає склеюванняня та випадання еритроцитів на дно пробіркиабо комірки у вигляді фестончастого осаду.

При негативній реакціїеритроцити осідають у вигляді «гудзика». Зазвичай у РНГА виявляють антитіла за допомогою антигенного еритроцитарного діагностикуму, який є еритроцитами з адсорбованими на них антигенами. Іноді застосовують антитілі еритроцитарні діагнос-тикуми, на яких адсорбовані антитіла. Наприклад, можна виявити ботулінічний токсин, додаючи до нього еритроцитарний антильний ботулінічний діагностикум (таку реакцію називають реакцією зворотноюнепрямої гемаглютинації -РОНГА). РНГА застосовують для діагностики інфекційних хвороб, визначення гонадотропного гормону в сечі при встановленні вагітності, для виявлення підвищеної чутливості до лікарських препаратів, гормонів та деяких інших випадках.

Реакція коаглютинації. Клітини збудника визначають за допомогою стафілококів, попередньо оброблених імунною діагностичною сироваткою. Стафілококи, що містять білок А,який має спорідненість з Fc-фрагментом імуноглобулінів, неспецифічно адсорбують антимікробні антитіла, які потім взаємодіють активними центрами з відповідними мікробами, виділеними від хворих. В результаті коаглютинації утворюються пластівці, що складаються зі стафілококів, антитіл діагностичної сироватки та обумовленого мікроба.

Реакція гальмування гемаглютинації(РТГА)заснована на блокаді, придушенні антигенів вірусівантитілами імунної сироватки, внаслідок чого віруси втрачають властивість аглютинувати еритроцити. РТГА застосовують для діагностики багатьох вірусних хвороб, збудники яких (віруси грипу, кору, краснухи, кліщового енцефаліту та ін) можуть аглютинувати еритроцити різних тварин.

Реакцію аглютинації визначення антирезусних антитіл (непряму реакціюКумбса) застосовують у хворих при внутрішньосудинному гемолізі. У деяких хворих виявляють антирезусні антитіла, які є неповними, одновалентними. Вони специфічно взаємодіють із резус-позитивними еритроцитами, але не викликають їх аглютинації. Наявність таких неповних антитіл визначають у непрямій реакції Кумбса. Для цього в систему антирезусні антитіла + резус-позитивні еритроцити додають антиглобулінову сироватку (антитіла проти імуноглобулінів людини), що спричиняє аглютинацію еритроцитів. За допомогою реакції Кумбса діагностують патологічні стани, пов'язані з внутрішньосудинним лізисом еритроцитів імунного генезу, наприклад, гемолітичну хворобу новонароджених: еритроцити резус-позитивного плоду з'єднуються з циркулюючими в крові неповними антитілами до резус-фактору, які перейшли через резус-фактор.

З метою встановлення точного діагнозу хворого обстежують комплексно. Загальний аналізкрові малоінформативний, його не використовують при діагностуванні венеричних інфекцій.

Види досліджень та біоматеріалів для аналізу

Для виявлення хвороби використовують різні методики та біоматеріали. На ранніх етапах сифіліс визначають за допомогою бактеріоскопічного тесту. Зразки досліджують під мікроскопом. Прилад дозволяє виявити штами збудника. Пізніше проводять серологічні аналізи. Завдяки їм, у пробах виявляють антигени та антитіла до хвороби.

Способи визначення статевої інфекції поділені на 2 категорії:

• Прямі, що виявляють патогенний мікроорганізм. До них відносять: темнопольна мікроскопія, RIT-аналіз (інфікування кроликів біоматеріалом для дослідження), метод ПЛР – полімеразної ланцюгової реакції (з його допомогою знаходять генетичні елементи збудника).
• Непрямі (серологічні) дозволяють виявити антитіла до патогену. Вони продукуються імунною системою, як реакція у відповідь на зараження.

Серологічні методики поділені на 2 категорії: трепонемні та нетрепонемні.

Нетрепонемні, що включають: тест з толуїдиновим червоним, аналіз РСК, RPR-тест, дослідження крові експрес-методом РМП.

Трепонемні, що поєднують: імуноблот, РСК-тест, РІТ-аналіз, дослідження РІФ, РПГА-тест, ІФА-аналіз.

Інформативність тестів на інфекцію різна. Найчастіше роблять основні види аналізів на сифіліс, до яких віднесено серологічні методики. Пацієнтам, які потребують обстеження, лікар призначає тести індивідуально.

Біоматеріал для дослідження

Щоб виявити бліду трепонему - патогена, який виглядає як спіраль і викликає сифіліс, беруть проби:

• венозної крові;
• ліквору (секрету зі спинномозкового каналу);
• вміст лімфатичних вузлів;
• тканини виразок.

Якщо необхідно провести тести на виявлення сифілісу, кров здають не лише з ліктьової вени, а й з пальця. На вибір біоматеріалу та спосіб дослідження впливає тяжкість перебігу інфекції та оснащеність діагностичного центру.

Прямі дослідження

Переконливим доказом сифілісу є виявлення збудників інфекції під мікроскопом. Таким способом знаходять патоген у 8 обстежуваних з 10. Негативний результат у 2 пацієнтів, що залишилися, не говорить про те, що вони не інфіковані.

Дослідження роблять на первинному та вторинному етапі (стадії) захворювання, для яких характерна поява висипань на шкірі та сифілом (виразок) на епітеліальних тканинахчи слизових оболонках. У відділенні з вогнищ ураження знаходять патогени, що викликають венеричне захворювання.

Точніше з визначенням трепонем справляється складний тест, що позначається як РІФ – реакція імунофлуоресценції. Зразок дослідження попередньо обробляють флуоресцентними антитілами. Сполуки, здатні світитися, склеюються з бактеріями. Розглядаючи під мікроскопом зразки, у разі зараження лаборант бачить блискучих збудників.

Тест використовують для раннього діагностування хвороби. Чим довше триває захворювання, тим нижче чутливість методів дослідження. Крім того, вона падає після оброблення висипів та виразок антисептичними засобами та у пацієнтів, які пройшли лікування. Зрідка дослідження дає хибнонегативні та хибнопозитивні результати.

RIT-аналіз – високоточний спосіб виявлення сифілісу. Під час проведення тесту результати доводиться чекати довго. До того часу, поки у інфікованого кролика не виявляться ознаки інфекції. Тест застосовують дуже рідко, незважаючи на те, що він надточний.

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції на сифіліс визначають генетичні елементи патогенів. Єдиний недолік ПЛР – дорожнеча.

Нетрепонемні тести

Такі аналізи крові допомагають виявити антитіла, що з'являються у відповідь на кардіоліпін – сполуку, що стосується загальної будовимембран патогенів

Реакція Вассермана (РВ чи RW)

Найвідомішим дослідженням на сифіліс вважається реакція Вассермана. РВ входить до категорії реакцій зв'язування комплементу (РСК). Нові методи РСК мають істотні відмінності від традиційної RW. Але позначаються вони, як і раніше, поняттям «реакція Вассермана».

Імунна система синтезує антитіла (маркери) у відповідь на вторгнення трепонем. Їх виявляють під час аналізу крові на сифіліс методом реакції Вассермана. Позитивний результат RW підтверджує інфікування обстежуваного.

Реакція гемолізу – індекс РВ аналізу. При ній взаємодіють 2 субстанції: гемолітична сироватка та еритроцити барана. Сироватку роблять, імунізуючи кролика еритроцитами барана. Активність біологічної рідини знижують шляхом прогрівання.

Показники РВ залежать від того, чи пройшов гемоліз. У пробі чистої маркерів відбувається гемоліз. У цьому реакція на антигени неможлива. Комплемент витрачається на взаємодію Космосу з баранячими еритроцитами. Коли в еталоні є маркери, комплімент вступає в реакцію з антигенами. У цьому випадку гемоліз не протікає.

Компоненти для RW відміряють у рівній кількості. Зразок, що містить сироватку, антиген та комплімент, прогрівають. Додають в пробу баранячі еритроцити та сироватку. Тримають при температурі 37 градусів, поки не настане гемоліз у контрольному зразку, який замість антигену містить фізрозчин.

Для РВ використовують готові антигени. На упаковках вказують титри та технологію їхнього розведення. Позитивний результат RW позначається хрестиками. Готові результати тестів позначаються так:

• ++++ - максимально позитивні (гемоліз затримався);
• +++ - Позитивні (гемоліз істотно запізнюється);
• ++ – слабко позитивні (гемоліз частково зволікав);
• + - сумнівні (гемоліз спізнився трохи).

При негативній РВ гемоліз повністю здійснився у всіх зразках. Але в деяких випадках отримують хибнопозитивні дані. Таке відбувається, коли кардіоліпін входить до складу клітин. Захисні механізми не продукують маркери до «рідного» кардіоліпіну.

Проте зрідка виникають виняткові ситуації. Позитивну RW виявляють у незаражених людей. Таке можливо, якщо пацієнт переніс тяжку хворобувикликану вірусами (пневмонію, малярію, туберкульоз, патології печінки та крові) Позитивним РВ буває у вагітних. Зумовлено це тим, що імунітет надмірно ослаблений.

Якщо виникає підозра, що результат аналізу на сифіліс хибнопозитивний, пацієнта обстежують додатково. Проблема в тому, що цю інфекцію неможливо виявити за єдиним клініко-лабораторним тестом. Частина досліджень дає хибні показники, які бувають як негативними, так і позитивними.

Отримати достовірні дані допомагає розгорнутий аналіз сифіліс. Завдяки йому встановлюють справжній діагноз: доводять зараження чи виключають його. Крім того, розширений тест дозволяє зупинити розвиток інфекції, виключити проведення непотрібної терапії.

РСК та РМП

Проводячи обстеження на сифіліс, традиційну реакцію Вассермана застосовують дуже рідко. Замість неї використовують метод РЗК. Аналіз дає позитивний результат через 2 місяці після інфікування. При вторинній формі захворювання він позитивний майже у 100% випадків.

Спосіб мікропреципітації (РМП) - дослідження з механізмом аналогічним реакції Вассермана. Методика проста у виконанні. Вона швидко проводиться. Для дослідження кров на сифіліс у цьому випадку здають із пальця. Методика дає позитивний результат через 30 днів із моменту появи сифілом. Помилки щодо не виключені. Хибнопозитивні дані отримують на тлі: інфекцій, що загострилися, пневмонії, інфаркту, інсульту, інтоксикації.

До помилкових тестів наводить:

Виявивши сумнівний аналіз на сифіліс, роблять трепонемні дослідження. Вони допомагають уточнити діагноз.

RPR та тест з толуїдиновим червоним

Метод плазмових реагінів (RPR) – черговий аналог реакції Вассермана. Його застосовують, коли необхідно:

• провести скринінг безсимптомних осіб;
• підтвердити сифіліс;
• досліджувати донорську кров.

Тест з толуїдиновим червоним, як і RPR, проводять, щоб оцінити динаміку лікарської терапії. Їхні показники падають при відступі хвороби, і збільшуються, коли патологія рецидивує.

Нетрепонемні аналізи показують наскільки хворий вилікувався. Отримання негативних результатів на сифіліс свідчить, що хвороба відступила повністю. Перше обстеження роблять через 3 місяці після курсової терапії.

Трепонемні дослідження

Високо результативні аналізи проводять за допомогою трепонемних антигенів. Їх роблять, коли:

• отримано позитивний результат за методу РМП;
• необхідно розпізнати помилкові дані, що виникають під час скринінгових тестів;
• підозрюють розвиток сифілісу;
• потрібно діагностувати потай поточну інфекцію;
• треба провести ретроспективну діагностику.

Тести РІФ та РІТ

У багатьох пролікованих хворих трепонемні дослідження проб дають позитивні результати тривалий час. За ними не можна судити про рівень ефективності лікування. РІТ та РІФ – надчутливі тести. Завдяки їм одержують достовірні дані. Ці аналізи трудомісткі, вони вимагають пристойних витрат часу, наявності прогресивного обладнання. Їх здатні проводити кваліфіковані медпрацівники.

Виконуючи РІФ аналіз на сифіліс, позитивні дані одержують через 2 місяці після інфікування. Негативні параметри підтверджують, що здоровий, що обстежується. Позитивні – дозволяють припустити, що людина інфікована.

РІТ проводять, коли реакція мікропреципітації позитивна. Такий аналіз крові на сифіліс допомагає спростувати чи засвідчити наявність інфекції. Тест надчутливий, він точно вказує на заражений пацієнт або здоровий. Але дослідження дає достовірні дані лише через 3 місяці після проникнення трепонему в організм.

Метод імуноблотінгу

До надточних тестів відносять імуноблотінг. Такий аналіз крові при сифілісі роблять нечасто. Його застосовують під час обстеження новонароджених дітей. Він не придатний для експрес-тестування. Позитивні результати отримують із запізненням. Їх набагато раніше дає метод мікропреципітації.

ІФА та РПГА

До інформативних надточних методів дослідження відносять тести ІФА та РПГА. З їхньою допомогою проводять експрес-діагностування. Лаборанти роблять величезну кількість таких аналізів. Завдяки їм вдається встановити точний діагноз.

РПГА аналіз на сифіліс позитивний через 30 днів після проникнення збудника в організм. З його допомогою діагностують первинну інфекцію, коли з'являються виразки та висипання.

Завдяки йому вдається виявити запущені, потай поточні, а також уроджені формипатології. Але проводять його спільно з нетрепонемними та трепонемними тестами. Комплексне діагностування гарантує достовірність результатів. Потрійне тестування доводить наявність або відсутність венеричної інфекції.

Позитивна реакція зберігається протягом великого часу. Тому дослідження не використовують для оцінки ефективності лікування.

ІФА аналіз позитивний через 21 день із моменту зараження. Тест іноді дає хибні результати. Вони виникають при системних патологіях, порушених обмінних процесах. Їхня результативність сумнівна у дитини, яка народилася від інфікованої матері.

Похибки, одержувані при серологічних методах дослідження, спричинили відкриття прогресивних методик діагностики. Газова хроматографія та мас-спектрометрія не дають хибних результатів. Єдина перешкода для їх масового використання – дорожнеча.

Алгоритм діагностування

• При знаходженні сифілісу в первинній фазі (до 60 днів з моменту інфікування), збудника відшукують на темному тлі або використовують для виявлення флюоресцирующие антитіла.
• Якщо патологія знаходиться у первинній, вторинній чи прихованій формі застосовують РМП та ІФА. Підтвердити результати РПГА допомагає аналіз крові на сифіліс.
• При рецидивах вторинної інфекції аналізують виразок, що відокремлюються, і висипань. Зі зразків витягують збудників, вивчають їх за допомогою мікроскопії.
• Коли захворювання входить до третинної фази, у 1/3 пацієнтів РМП негативна. При цьому результати ІФА та РПГА позитивні. Однак вони не завжди вказують на третинний період, а підтверджують, що людина раніше перенесла інфекцію. Слабопозитивний тест – доказ повного лікування, а чи не розвитку третинної фази.
• Підтверджуючи вроджений сифіліс, аналіз крові беруть у матері та немовляти. Порівнюють дані тестів РМП. Враховують те, що у малюка ІФА та РПГА позитивні. Підтверджують діагноз, використовуючи методику иммуноблоттинга.

Сифіліс, як і будь-яка системна патологія, вражає весь організм. Тому обстеження нею проходять при вагітності, перед абортом. Пацієнткам роблять РМП, ІФА, РПГА.

Як здати аналіз

Відправляє пацієнтів на аналіз лікар-венеролог. Приватні лабораторії роблять анонімні дослідження на сифіліс за бажанням клієнта. Для складання тесту в них не потрібне направлення лікаря.

Правила проведення дослідження:

• Кров у лабораторії беруть уранці на порожній шлунок (їдять після процедури). До аналізу можна пити лише воду.
• За 2 доби до обстеження заборонено: харчуватися жирною їжею та вживати спиртне.
• Кров беруть із пальця чи вени.
• Скільки триває дослідження? Зазвичай не більше доби. Розшифровку аналізів на сифіліс отримують у лаборантів або лікаря.
• Скільки дійсний тест? Після 3 місяців результати аналізів втрачають чинність. Їх знову здають.

Якщо розшифровка аналізу показує, що тест є позитивним, необхідно відвідати венеролога, який призначить додаткове обстеження для точного підтвердження діагнозу та підбере схему необхідного лікування.

Тестування спинномозкового вмісту

Діагноз нейросифіліс ставлять після дослідження ліквору. Такий аналіз роблять:

• людям із прихованою формою інфекції;
• при симптомах захворювань нервової системи;
• безсимптомний, запущений нейросифіліс;
• хворим з позитивними серологічними реакціями.

Напрямок на дослідження ліквору дає лікар. Зі спинномозкового каналу беруть пункцію в 2 пробірки. Прокол змащують йодом, закривають стерильною серветкою. Після процедури пацієнт дотримується постільного режиму протягом 2 днів.

У 1 зразку визначають кількість білка, клітин, сліди менінгіту. У другій пробі обчислюють антитіла до збудника сифілісу. І тому роблять тести: РВ, РМП, РИФ і РИБТ.

Залежно від того, скільки виявлено порушень, розрізняють 4 різновиди ліквору. Кожна вказує на певні ушкодження нервової системи. Лікар діагностує:

Крім того, за результатами тестів судять про одужання пацієнта.

Інтерпретація тестів – завдання лікаря. Тільки він здатний зробити правильні висновки, за потреби призначити додаткове обстеження, поставити точний діагноз. Не варто робити самостійну діагностику за небезпечної системної патології. Помилка в діагнозі спричиняє серйозні наслідки.

Реакція зв'язування комплементу (РЗК)

Реакція зв'язування комплементу (РСК) ставиться у дві фази: у першій фазі антиген з'єднують з досліджуваною сироваткою, в якій припускають наявність антитіл і додають комплемент, інкубують термостаті 30 хвилин.

Друга фаза: додають гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка). Після інкубації термостаті протягом 30 хвилин враховують результат.

При позитивній РЗК антитіла сироватки, з'єднавшись з антигеном, утворюють імунний комплекс, який приєднує до себе комплемент, і гемолізу не відбудеться. Якщо реакція негативна (антитіл у досліджуваної сироватки немає) – комплемент залишиться вільним і станеться гемоліз.

РЗК застосовується для серологічної діагностики сифілісу, гонореї, висипного тифу та інших захворювань.

Реакції імунітету з використанням мічених антигенів і антитіл засновані на тому, що один з інгредієнтів, що беруть участь у реакції (антигени або антитіла), з'єднують з якоюсь міткою, яку легко можна виявити. Як мітки використовують флюорохроми (РІФ), ферменти (ІФА), радіоізотопи (РІА), електрооплотні сполуки (ІЕМ).

Імуноферментний аналіз (ІФА), як і інші реакції імунітету, використовується: 1) для визначення невідомого антигену за допомогою відомих антитіл або 2) для виявлення антитіл у сироватці за допомогою відомого антигену. Особливість реакції в тому, що відомий інгредієнт реакції з'єднаний із ферментом (наприклад, пероксидазою). Присутність ферменту визначають за допомогою субстрату, що при дії ферменту забарвлюється. Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА.

1) Виявлення антигену. Перший етап - адсорбція специфічних антитіл на твердій фазі, як яку використовують полістиролові або полівінілхлоридні поверхні лунок пластикових панелей. Другий етап – додавання досліджуваного матеріалу, в якому передбачається наявність антигену. Антиген зв'язується із антитілами. Після цього лунки промивають. Третій етап - додавання специфічної сироватки, що містить антитіла проти даного антигену, мічені ферментом. Мічені антитіла приєднуються до антигенів, які надлишок видаляється промиванням. Таким чином, якщо досліджуваний матеріал має антигени, на поверхні твердої фази утворюється комплекс антитіла - антиген - антитіла, мічені ферментом. Для виявлення ферменту додають субстрат. Для пероксидази субстратом служить ортофенілендіамін у суміші з Н 2 Про 2 у буферному розчині. Під дією ферменту утворюються продукти, що мають коричневе забарвлення.

2) Виявлення антитіл. Перший етап – адсорбція специфічних антигенів на стінках лунок. Зазвичай у комерційних тест-системах антигени вже адсорбовані на поверхні лунок. Другий етап – додавання досліджуваної сироватки. За наявності антитіл утворюється комплекс антиген-антитіло. Третій етап – після відмивання у лунки додають антиглобулінові антитіла (антитіла проти людських глобулінів), мічені ферментом. Результати реакції оцінюють, як зазначено вище.

Як контроль використовують зразки свідомо позитивні і свідомо негативні, які є в комерційних системах.

ІФА застосовується для діагностики багатьох інфекційних захворювань, зокрема ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів.

Імуноблот - це різновид ІФА (поєднання електрофорезу та ІФА). Методом електрофорезу в гелі поділяють біополімери, наприклад антигени вірусу імунодефіциту людини. Потім переносять розділені молекули на поверхню нітроцелюлози в тому ж порядку, як вони знаходилися в гелі. Процес перенесення називається блот, а отриманий відбиток - блот (англ. blot - пляма). Цей відбиток діють досліджуваної сироваткою. Потім додають сироватку проти глобулінів людини, мічену пероксидазою, потім субстрат, який під дією ферменту набуває коричневого кольору. Утворюються коричневі смуги тих місцях, де антитіла з'єдналися з антигенами. Метод дозволяє виявити антитіла до окремих антигенів вірусу.

Радіоімунний аналіз (РІА). Метод дозволяє визначити кількість антигену в досліджуваній пробі. Спочатку до імунної сироватці приєднують матеріал, ймовірно містить антиген, потім відомий антиген, мічений радіоізотопом, наприклад I 125 . В результаті відбувається зв'язування визначеного (німецького) та відомого міченого антигену з обмеженою кількістю антитіл. Оскільки мічений антиген додається у певній дозі, то можна визначити, яка його частина зв'язалася з антитілами, а яка залишилася вільною через конкуренцію з неміченим антигеном і була видалена. Кількість міченого антигену, що зв'язався з антитілами, визначають за допомогою лічильника. Воно обернено пропорційно кількості визначеного антигену.

Імуноелектронна мікроскопія (ІЕМ). До антигену, наприклад, до вірусу грипу, приєднується специфічна антисироватка, мічена електроноплотною речовиною. Як мітки застосовують металовмісні білки (феритин, гемоціанін) або колоїдне золото. При мікроскопії в електронному мікроскопі роблять фотографії, на яких видно віріони грипу з темними точками, що приєдналися до них, - молекулами мічених антитіл.

Набутий імунітет, відмінність його від спадкового (видового, вродженого). Види набутого імунітету.

Завдання.У сім'ї захворіла на дифтерію дитина Валерій, трьох років. Інші члени сім'ї не захворіли, причому мати перехворіла на дифтерію в дитинстві, а батько був щеплений дифтерійним анатоксином. Старша сестра Наташа, п'яти років, свого часу не була щеплена дифтерійним анатоксином через медичні протипоказання, тому довелося провести їй екстрену профілактику за допомогою протидифтерійної антитоксичної сироватки. Молодший брат, Віталій, трьох місяців не захворів, хоча нічим не був щеплений. У будинку є кішка та собака, вони не захворіли. Назвіть для кожного з членів сім'ї та для тварин вид імунітету, завдяки якому вони не захворіли.

Що таке антиген? Які речовини можуть бути антигенами? Повноцінні антигени та гаптени, чим вони відрізняються один від одного? Структура антигену. Як називається частина молекули антигену, що визначає його специфічність? Назвіть відомі вам антигени. Що таке аутоантигени? Антигенна будова мікробної клітини. Жгутикові та соматичні антигени; локалізація, літерне позначення, хімічна природа, ставлення до температури, спосіб отримання, практичне застосування. Анатоксин, його властивості, застосування, одержання. Яка тканина становить імунну систему? Вкажіть центральні та периферичні органи імунної системи людини. Опишіть процес формування гуморальної та клітинної імунної відповіді. Вкажіть клітини, які здійснюють захоплення та перетравлення антигену; клітини, що взаємодіють при формуванні гуморального імунітету, клітинного імунітету; клітини, які трансформуються та перетворюються на плазмоцити, що продукують антитіла; клітини, що стимулюють цей процес; клітини, які пригнічують імунну відповідь; клітини, які вбивають пухлинні клітини, та заражені вірусом клітини. Що таке антитіла? Як отримати імунну сироватку? Як отримати сироватку, яка б нейтралізувала правцевий токсин? Проти яких антигенів утворюються антитоксини, аглютиніни, гемолізини? Які антитіла утворюються під час введення в організм дифтерійного анатоксину? дифтерійних бактерій? Хімічна природа та структура антитіл. Що таке активний центр імуноглобуліну? Перерахуйте класи імуноглобулінів, їх властивості. Вкажіть клас імуноглобулінів, здатних проникати крізь плаценту. До якого класу належать секреторні імуноглобуліни? Динаміка накопичення антитіл. Чим відрізняється вторинна імунна відповідь від первинної? Як у практичній медицині використовуються знання про динаміку імунної відповіді? Що таке реакції імунітету, який їхній механізм, фази реакції. У яких 2 напрямках використовують реакції імунітету? Перерахуйте реакції імунітету.

Завдання.Поставте замість пропущених слів «анатоксин» або «антитоксин»: _________ є антигеном, _________ є антитілом, __________ створює при введенні в організм активний імунітет, __________ створює при введенні в організм пасивний імунітет, __________ отримують шляхом імунізації тварин, __________ отримують з токси формаліном та теплом, ___________ нейтралізує токсини, __________ викликає в організмі утворення антитіл.

Реакція аглютинації: що таке аглютинація, що є антигеном, що – антитілом; способи постановки, які контролі ставляться і навіщо; як мають виглядати контролі. Аглютинуючі сироватки, що вони містять, як їх отримують, для чого застосовуються; що таке титр аглютинуючої сироватки? Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації: що служить антигеном у цій реакції, як його одержують, механізм реакції. Що таке еритроцитарний діагностикум? Що таке античний еритроцитарний діагностикум? Реакції преципітації: що таке преципітація, що є антигеном; як отримати сироватку, що преципітує? Що таке титр преципітуючої сироватки? Методи постановки, практичне застосування.

Реакція зв'язування комплементу (РЗК): принцип РЗК; що утворюється при взаємодії імунної сироватки зі специфічним антигеном; що відбувається з комплементом, якщо він є при цьому взаємодії? Яка доля комплементу у тому випадку, якщо між антигеном та антитілами немає специфічної спорідненості? Якщо кінцевим результатом РСК є гемоліз, що це означає – позитивний чи негативний результат? Методика постановки РЗК. Чому досліджувану сироватку треба інактивувати? Гемолітична сироватка: що містить, як її одержують, що таке титр і як його визначають? Комплемент: хімічна природа, ставлення до високої температури, де міститься? Як можна зруйнувати комплемент? Що практично застосовується як комплемент?

Завдання.На одязі людини, звинуваченої у вбивстві, виявлено пляму крові. За допомогою якої реакції можна визначити, чи це людська кров; що в цій реакції буде антигеном і що антитілами; який діагностичний препарат потрібно мати у лабораторії для цієї реакції, як його готують?

Завдання.Як за допомогою реакції преципітації визначити, чи доставлений для аналізу зразок м'яса великої рогатої худоби або м'яса коня; які необхідні діагностичні препарати?

Реакція преципітації в агаровому гелі, способи постановки, практичне застосування.

Що свідчить серологічний аналіз крові?

Що свідчить серологічний аналіз крові? Діагностичні заходи – це найважливіший етап у терапії будь-якого захворювання. Успіх лікування залежить не тільки від призначених препаратів, а й багато в чому від того, наскільки правильно було встановлено діагноз.

Крім того, діагностика дозволяє запобігти ускладненням і хвороби, що супруводжують. За допомогою серологічного аналізу крові пацієнта виявляють наявність антитіл та антигенів. Дослідження допомагає знайти безліч захворювань, визначити їх фазу та контролювати проходження лікування.

Що таке серологія?

Серологією називається галузь імунології, що вивчає реакції антигенів на антитіла. Цей розділ медицини займається вивченням плазми крові та її імунологічних характеристик.

На сьогоднішній день серологічний аналіз крові на антитіла – це надійний спосіб виявлення вірусу імунодефіциту людини, гепатиту, бруцельозу, ЗПСШ та інших небезпечних для життя захворювань. Розберемося, у яких випадках його призначають.

Показання до призначення

Серологічний аналіз крові необхідний виявлення збудника хвороби при труднощі у постановці діагнозу.

Для проведення цієї реакції в плазму вводять антигени збудників, а потім процес, що протікає, вивчає лаборант. Або здійснюють зворотну реакцію: в інфіковану кров вводять антитіла визначення конкретної приналежності збудника.

Сфера використання

Дане дослідження використовують у різних галузях медицини. За допомогою цієї реакції виявляють специфічні клітини та антитіла, що виробляються організмом для того, щоб боротися з інфекціями та вірусами.

Крім того, за допомогою серологічного методу визначається група крові людини.

Подібне серологічне дослідження аналізу крові використовують у гінекології для діагностики хвороб, що передаються статевим шляхом. Практикується такий метод і для комплексних обстежень вагітних жінок (виявлення токсоплазмозу, ВІЛ, сифілісу тощо). Проходження цього тесту є обов'язковим під час постановки на облік у жіночій консультації.

У дітей серологічна реакція використовується для підтвердження діагнозу так званих дитячих захворювань (вітрянки, кору, краснухи і т. д.) у тому випадку, якщо симптоматика не має виражених проявів і неможливо виявити хворобу, аналізуючи клінічні показання.

Виявлення венеричних захворювань

Для венерологів це тестування насправді незамінне і дозволяє поставити діагноз дуже точно.

При змащеній клінічній картині серологічний аналіз крові на сифіліс, лямбліоз, уреаплазмоз, хламідіоз, герпес та інші захворювання дає змогу швидко виявити наявність антитіл.

Вірусні та інфекційні захворювання

Серологічний аналіз активно використовується гастроентерологами, гепатологами та інфекціоністами для діагностики вірусного гепатиту.

Розшифрування серологічного аналізу крові дає можливість визначити стадію перебігу захворювання та відповісти на запитання, наскільки необхідна госпіталізація на даний момент. Як правильно підготуватись?

Підготовка до здачі аналізу

Серологічний аналіз крові роблять і в державних, і комерційних клініках. Перевагу варто віддати лабораторії, що має сучасне обладнання і кваліфікований персонал.

Біологічними зразками для дослідження можуть бути слина та кал, але здебільшого використовується венозна кров хворого. Кров для серологічного тесту беруть із ліктьової вени в умовах лабораторії. Перед тим, як здавати аналіз, слід проконсультуватися з лікарем щодо підготовки до цієї процедури.

Для підготовки до здачі аналізу на серологічне дослідження необхідно дотримати кілька нескладних правил.

Кров здають у спокійному стані до їди, тобто натще. Перед цим не слід проходити інші дослідження, наприклад, робити рентген, УЗД і т.д.

Потрібно виключити прийом антибактеріальних та інших препаратів за кілька тижнів до здачі крові. Певні рекомендації у разі залежать від захворювання, яким робиться тест. Наприклад, дослідження на гепатит передбачає виключення жирної їжі та алкоголю за 48 годин до процедури.

Реакція флюоресценції

Серед різновидів серологічних реакцій є реакція флюоресценції. За цією методикою використовується реагент, що підсвічує антитіла у сироватці крові.

Постановка серологічної реакції прямого типу передбачає маркування специфічних антитіл речовиною, що флюорескує. Така реакція є найшвидшою та проводиться одноетапно.

Інший варіант проведення такого аналізу має назву непрямого, або РНДФ. Проводиться він у два етапи. У першому етапі антитіла не маркуються флюоресцирующими мітками, але в другому застосовуються відповідно зазначені антитіла визначення антигенів і антитіл. Світло виникає тільки після того, як відбувається зв'язування зі специфічним антитілом.

Що ж свідчить серологічний аналіз крові? Підсумок усієї процедури оцінює спеціальний прилад, який аналізує силу випромінювання, виявляє форму та розмір об'єкта, що досліджується. Збудники інфекційних захворювань виявляються з результатом, достовірність якого становить %, залежно від виду та стадії патології.

Імуноферментний аналіз

У цих видах серологічного дослідження використовуються унікальні стабільні реагенти. Зазначені речовини начебто приклеюються до шуканих антитіл. У результаті ми отримуємо якісний чи кількісний результат.

Якщо виражених маркерів не виявилося, результат буде вважатися негативним. Якщо присутність антитіл у біологічних зразках при якісному дослідженні виявлено, результат аналізу вважається позитивним. При кількісному визначенні клітин аналіз дає точніший результат.

Аналізуючи показники аналізу (наприклад, суму виявлених клітин) фахівець визначає, чи перебуває захворювання на початковому етапі, у гострій стадії, чи це загострилася хронічна формапатології. Щоб поставити діагноз, лікар враховує як дані серологічного дослідження, а й клінічну картинузахворювання.

Особливості даного тесту

Проведення даного аналізу не завжди здатне дати 100% впевненість у тому, що певне захворювання виявлено. Буває так, що результати можуть бути неоднозначними і потрібне проведення інших процедур.

Наприклад, під час дослідження на бруцельоз сироватка крові проходить контроль самозатримки без антигену. Це значно підвищує достовірність тестування. Аналіз на бруцельоз може мати позитивне чи негативне значення, а також викликати сумніви.

При отриманні сумнівних результатів, які мають однозначної трактування, рекомендовано здати аналіз повторно. Крім того, бруцельоз можна виявити в результаті посівів крові, дослідивши кістковий мозокта спинно-мозкову рідину.

Плюси серологічного аналізу крові

Діагностичні методики з використанням серологічних реакцій широко застосовують у сучасної медичної практиці. Особливо це робиться щодо вірусних і інфекційних патологій.

Ці ж аналізи застосовуються при проведенні географічного скринінгу та медичного обстеженняз метою запобігання епідеміологічному поширенню інфекції.

До переваг методу можна віднести:

• Високий рівень достовірності.
• Швидке проведення реакції та отримання результатів. Результати РЗК відомі вже через 24 години. За особливої ​​ситуації, в умовах стаціонару, аналіз буде готовий за кілька годин.
• Здійснення контролю розвитку хвороби та ефективності терапії, що проводиться.
• Невисока вартість та доступність для пацієнтів.

Мінуси методу

Проте серологічні дослідження мають свої недоліки.

До них відноситься той факт, що при проведенні аналізу слід враховувати Інкубаційний періодзахворювання, щоб отримати більш достовірну картину.

Наприклад, визначення простого герпесупершого чи другого типу можливе лише через 14 днів із моменту зараження. Аналіз на наявність вірусу імунодефіциту проводять через 30 днів, через 90 днів та через півроку після контакту з інфікованою людиною.

Безумовно, на достовірність результатів може впливати і людський фактор: нехтування правилами підготовки до забору крові чи помилка, допущена лаборантом під час проведення реакції.

За статистикою, помилковий результат може бути отриманий у 5% випадків. Досвідчений лікар під час обстеження пацієнта, вивчивши клінічну картину, найчастіше може обчислити допущену помилку.

Які аналізи крові здають на сифіліс: RW, РПГА, ІФА, VDRL, RPR, РІБТ, розшифрування результатів тестів

Сифіліс – захворювання інфекційної природи, обумовлене спірохетою Treponema pallidum, схильна до прогредієнтного хронічною течією, з чіткою періодизацією клінічної симптоматики

Переважна більшість статевого шляху передачі над контактним і трансплацентарним ставить це захворювання до ряду венеричних (ЗПСШ, ІПСШ). Крім зазначених способів передачі інфекції особливу роль відіграє артифікаційний шлях (від лат. Artificio - штучно створений).

Він характерний для медичних установ, переважно, реалізується за умов стаціонару. Інфікування відбувається при гемотрансфузіях, різних хірургічних операціях, інвазивних діагностичних методах

Незважаючи на карантинізацію донорської крові, проблема виявлення сифілісу у донорів на різних стадіях захворювання все ще є актуальною.

Тому діагностичні заходи при сифілісі вимагають стандартизації, впровадження нових чутливих та інформативних методів ідентифікації, а також зведення до мінімуму помилок та неправильного трактування результатів аналізів.

Класифікація методів лабораторної діагностики

Діагностика сифілісу має деякі особливості та відрізняється від діагностики інших бактеріальних інфекцій. Складна будова та антигенні властивості блідої трепонеми зумовлюють помилки в інтерпретації результатів серологічних реакцій.

Здати аналіз крові на сифіліс пропонують 3 основним групам пацієнтів:

1. 1 Скринінг та диспансеризація груп населення (у тому числі і вагітність, постановка на облік у жіночій консультації, надходження на роботу та оформлення медкнижки тощо).
2. 2 Скринінг у групах ризику (незахищені статеві контакти з людиною, інфікованою сифілісом, особи після примусових сексуальних контактів, ВІЛ-інфіковані тощо).
3. 3 Особи, які мають симптоми захворювання, або особи з підозрою на сифілітичну інфекцію.

всі лабораторні методиумовно поділяють на прямі та непрямі.

Прямі методи

1. 1 Ідентифікація Treponema pallidum у темному полі (темнопольна мікроскопія).
2. 2 Зараження піддослідних тварин (культивування в лабораторних тваринах).
3. 3 ПЛР (полімеразно-ланцюгова реакція).
4. 4 ДНК-зонд або гібридизація нуклеїнових кислот.

Непрямі методи

Серологічні реакції - це методи лабораторної діагностики, що базуються на виявленні антитіл (скорочено АТ) до антигенів блідої трепонеми (скорочено АГ). Вони мають основне значення для підтвердження діагнозу.

1. 1 Нетрепонемні тести:
   • Реакція Вассермана (РЗК);
   • Реакція мікропреципітації (МР, РМП) та її аналоги, які наведені нижче;
   • Тест швидких плазмових реагінів (RPR, РПР);
   • Тест з червоним толуїдином та сироваткою (TRUST);
   • Нетрепонемний тест Лабораторії дослідження венеричних хвороб – VDRL.
2. 2 Трепонемні тести:
   • Р-ція іммобілізації Treponema pallidum - РІБТ / РІТ;
   • Р-ція імунофлюоресценції - РІФ, FTA (розведення сироваток РІФ-10, РІФ-200, РІФ-абс);
   • Р-ція пасивної гемаглютинації (РПГА, ТРПГА, TPHA);
   • Імуноферментний аналіз (ІФА, EIA);
   • Імуноблот.

Малюнок 1 - Алгоритм серодіагностики сифілісу

Гістоморфологічні методи

Ці методи зводяться до виявлення особливостей гістоморфології сифілітичних проявів. Увага приділяється тонкощам будови твердого шанкеру. Однак, диференційна діагностикаінфекції за допомогою гістології дуже скрутна. Гістоморфологія використовується з іншими лабораторними та клінічними тестами.

Мікроскопія Treponema pallidum у темному полі

Цей метод ґрунтується на безпосередньому виявленні блідої трепонеми в досліджуваному матеріалі за допомогою мікроскопа та спеціальних пристосувань (найчастіше відокремлюваних ерозій та виразок, рідше) спинномозкова рідината інші субстрати).

За допомогою скарифікації, зішкрібання, здавлювання з ерозій та виразкових дефектів отримують ексудат, потім досліджують у мікроскоп підготовлений препарат.

Зазвичай бліді трепонеми виявляють у препараті, отриманому з шанкеру, з вогнищ вторинного свіжого, вторинного рецидивного сифілісу, пунктату лімфовузлів, плаценти.

Заснований на феномені світіння дрібних частинок у темному полі при попаданні променя світла (феномен Тіндаля), метод чудово дозволяє диференціювати збудника сифілісу від інших трепонем на підставі морфологічних відмінностей та відмінностей у способах пересування бактерії.

Для мікроскопії використовують спеціальний темнопольний конденсор відповідної оптичної роздільної здатності. Препарат одержують способом розчавленої краплі (краплю матеріалу наносять на чисте знежирене предметне скло та закривають дуже тонким покривним).

На покривне скло капають імерсійну олію. За допомогою повороту тубуса і повороту лінзи, що збільшує, регулюють потрібне освітлення.

У темному полі мікроскопа виявляються клітини крові, епітеліальні клітини та сам збудник сифілісу. Бліда трепонема виглядає як спіраль, дуже тонка, що випромінює сріблястий колір, з плавними рухами.

Малюнок 2 – Темнопольна мікроскопія як спосіб візуалізації блідої трепонеми у досліджуваному матеріалі. Джерело ілюстрації - CDC

Treponema pallidum необхідно відрізняти від інших трепонем, у тому числі Tr. refringens, яка може міститися в ротоглотці та на слизовій оболонці статевих органів. Ця бактерія здійснює хаотичні рухи, має широкі та несиметричні, досить грубі завитки. Крім того, Treponema pallidum відрізняють від Tr. Microdentium, Tr. Buccalis та Tr. vincenti.

Візуалізація бактерій у темному полі іноді доповнюється реакцією флюоресценції. Для цього мічені флюоресцентним барвником протитрепонемні АТ додають у нативний матеріал. При цьому утворюється комплекс, званий антиген-антитіло (скорочено АГ-АТ), який є об'єктом для дослідження за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

ПЛР, розроблена в 1991 році для виявлення молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) блідої трепонеми, є високочутливою та специфічною, дозволяє виявити фрагменти ДНК збудника.

Базується даний аналіз на копіюванні коротких ділянок ДНК блідої спірохети, який задовольняє заданим параметрам і є присутнім у зразку. Все це виконується у штучних умовах (in vitro). Реакція проводиться у приладі – ампліфікаторі, який забезпечує періодизацію температурних циклів. Відбувається охолодження з наступним нагріванням пробірок з похибкою 0,1?

ДНК-матрицю прогрівають протягом 2 хвилин при температурі 92-98С (максимальна температура використовується, якщо полімераза термостабільна). При нагріванні ланцюга ДНК розходяться через розпад водневих зв'язків між ними. У стадії відпалу температуру реакції знижують для зв'язування праймера з одноланцюгової матрицею.

Відпал займає близько 30 секунд, протягом цього часу синтезуються сотні нуклеотидів. Знову синтезовані молекули копіюються полімеразою, в результаті багаторазово збільшуються специфічні фрагменти дезоксирибонуклеїнової кислоти. Подальша детекція фрагментів проводиться за допомогою електрофорезу в гелі агар.

ПЛР-діагностика сифілісу поки що має експериментальний характер, але виправдана при виявленні уродженої інфекції, у складних діагностичних випадках або за мінімального вмісту блідих трепонем у досліджуваному матеріалі.

ДНК-гібридизація

ДНК-гібридизація виконується in vitro і заснована на повному або частковому з'єднанні двох одноланцюгових молекул ДНК в одну молекулу. У разі повної відповідності комплементарних фрагментів об'єднання відбувається легко. Якщо комплементарна відповідність часткова, то поєднання ланцюжків ДНК відбувається повільно. З часу злиття ланцюгів можна оцінити ступінь комплементарності.

При нагріванні ДНК у буферному розчині розриваються водневі зв'язки азотистими основами, що є комплементарними, в результаті ланцюжка ДНК розходяться. Далі отримують препарат із двох денатурованих дезоксирибонуклеїнових кислот. При охолодженні одноланцюгові ділянки ренатурують. Утворюється так званий гібрид ДНК.

Метод дозволяє оцінити та аналізувати швидкість відпалу, враховуючи особливості (подібності та відмінності) ДНК між видами або всередині виду.

Застосування ДНК-зонда полягає у гібридизації міченого фрагмента ДНК зі специфічною ділянкою ДНК для ідентифікації комплементарних послідовностей нуклеотидів. Для мітки зонда використовується група ненасичених атомів (хромофори) чи радіоактивні ізотопи.

ДНК-зонд застосовують для гетерогенного та гомогенного детектування нуклеїнових кислот. Роль зонда полягає у визначенні ділянок, на яких відбулося злиття мішень-зонд. Детектування в гомогенній системі має перевагу – дозволяє відстежити гібридизацію молекул ДНК у реальному часі.

Суть методу зводиться у денатурації ДНК та ренатурації (возз'єднання ланцюжків ДНК). Процес ренатурації нуклеїнової кислоти та ДНК-зонда закінчується утворенням «гібриду».

Специфічні послідовності нуклеїнових кислот гібридизуються з ДНК-зондом і, таким чином, виявляються та дозволяють оцінити кількість ДНК у досліджуваному матеріалі.

Зараження лабораторних тварин

Висока чутливість кроликів до Treponema pallidum (близько 99,9%) дозволяє застосовувати їх у діагностиці сифілітичної інфекції.

Зараження кроликів проводиться у науково-дослідних центрах та є «золотим стандартом» оцінки чутливості інших методів.

Повернемося до трепонемних та нетрепонемних тестів, оскільки вони використовуються найчастіше. Розглянемо їх переваги та недоліки, а також помилки в інтерпретації результатів.

Нетрепонемні тести

Це тести визначення антитіл IgGта IgM до стандартизованого кардіоліпінового антигену. Їхнім суттєвим недоліком є ​​порівняно невелика специфічність.

Низька вартість та простота виконання дозволяють віднести ці тести до відбіркових діагностичних, необхідних для встановлення попереднього діагнозу та скринінгу серед населення.

Саме нетрепонемні тести здаються під час оформлення медичної книжки, влаштування на роботу, постановки на облік у жіночій консультації.

1. 1 Мінімальна чутливість у стадії сифілісу первинного – 70%;
2. 2 Мінімальна чутливість у стадії сифілісу пізнього – 30%;
3. 3 Можливість появи хибнонегативних і хибнопозитивних результатів;
4. 4 Трудомісткість виконання РЗК.

1. 1 Відносно невелика вартість виробництва тестів;
2. 2 Отримання швидкої відповіді;
3. 3 Можливість їх застосування для скринінгу.

Отримання хибнопозитивних або слабопозитивних проб можливе в таких випадках:

1. 1 Порушення технології виконання при блокуванні комплексу АГ-АТ.
2. 2 Наявність у хворого аутоімунних захворювань(ревматоїдний артирит, ревматизм, склеродермія, системний червоний вовчак, саркоїдоз та ін.).
3. 3 Злоякісні новоутворення.
4. 4 Вірусні та бактеріальні інфекції.
5. 5 Ендокринні захворювання(Аутоімунний тиреоїдит, цукровий діабет).
6. 6 Вагітність.
7. 7 Вживання алкоголю.
8. 8 Прийом жирної їжі.
9. 9 Старецький вік.

Як видно зі списку, є достатньо причин для невірного результату. Тому до нього слід дуже насторожено ставитись. Розглянемо поруч із РСК ще дві проби. Це реакція мікропреципітації та VDLR (її модифікація).

Реакція зв'язування комплементу (РСК, Вассермана, RW)

Це проба, заснована на можливості комплементу зв'язуватися з комплексами АГ-АТ. Ідентифікують комплекс, що утворився, за допомогою гемолітичної системи. Кардіоліпіновий антиген помітно підвищує чутливість проби.

Чутливою є реакція Колмера, яка полягає у виконанні при різних температурних режимах. Так, перша фаза реакції Колмера протікає при температурі 20С протягом півгодини, друга фаза при тепературі 4-8С протягом 20-ти годин. За цей час відбувається зв'язування комплементу.

За виконання РСК можливе отримання різко позитивних результатів. Причиною, ймовірно, є великий титр антитіл у сироватці. У цьому випадку проби ставлять із зменшуючими дозами.

Для диференціювання стадій сифілісу та оцінки ефективності протисифілітичного лікування визначають кількість АТ у сироватці.

Позитивність проби оцінюють за допомогою хрестів, також у реакціях Вассермана, Колмера та Канна вказується розведення сироватки.

Реакція мікропреципітації

Так як трудомісткість виконання вищезазначених проб велика, то для широти охоплення диспансеризацією різних груп населення розроблено прискорений спосібсеродіагностики сифілісу, так званий експрес-метод – реакція мікропреципітації (скорочено МР, РМП).

Вона виконується з кардіоліпіновим антигеном та допоміжними речовинами. Його перевагою є забір периферичної крові для дослідження. Це значно прискорює і саму методику, і роботу лаборантів.

Малюнок 2 - Реакція мікропреципітації (схема)

Для проведення МР потрібна плазма або інактивована сироватка крові пацієнта (саме вони містять антитіла). Далі плазму поміщають у марковані лунки. Потім до досліджуваного матеріалу додають краплю кардіоліпінового антигену, змішують і струшують. У результаті сироватці інфікованого виникають характерні пластівці, різні за рівнем інтенсивності.

Це якісна проба. При кількісній оцінці використовуються 10 розведень сироватки, що міститься в 10 лунок з відповідним маркуванням. При якісній МР відповідь указується у вигляді хрестів (плюсів) або мінусу, при кількісній вказується титр антитіл (1:2, 1:4 тощо).

Наявність пластівців розцінюється як позитивна або слабопозитивна відповідь. Можлива поява флокуляту та за відсутності захворювання, тому остаточну оцінку отриманого результату проводять після контрольного дослідження або проведення інших реакцій (РІБТ, РІФ, ІФА, РПГА).

Рекомендований Всесвітньою організацією охорони здоров'я метод постановки реакції з антигеном ліпоїдної природи (АГ) вважається найкращим серед інших стандартних нетрепонемних тестів. Розроблено в США, штат Джорджія в лабораторії венеричних хвороб (Veneral Diseases Research Laboratories).

Абревіатура закладу стала назвою для проби – VDRL. VDRL – це модифікація МР. Сироватку від хворого на сифіліс інактивують і поміщають на предметне скло. Використовуваний антиген складається з кардіоліпіну, холестерину та лецитину в різному відсотковому співвідношенні. Відповідь реєструється практично одразу.

Виразна флокуляція виникає у присутності в сироватці антитіл. Сироватка стає реактивною після 4-х тижнів після зараження. Для оцінки кількості антитіл сироватку попередньо розводять в геометричній прогресії.

1. 1 порівняно висока чутливість;
2. 2 порівняно висока специфічність;
3. 3 легкість виконання;
4. 4 мала вартість реактивів;
5. 5 отримання швидкої відповіді.

Недоліком VDRL є відносно висока частота хибнопозитивних результатів.

Їх причинами є ті самі перелічені вище захворювання.

Трепонемні випробування виконуються зі специфічними АГ Treponema pallidum. Вони необхідні та обов'язкові для встановлення остаточного діагнозу. Це реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакції непрямої гемаглютинації (РПГА), імуноферментний аналіз (ІФА) та ін.

Після позитивного результату нетрепонемного тесту (RPR, MP, VDRL) завжди мають виконуватися трепонемні (частіше комбінація - РПГА, ІФА, РІФ).

Трепонемні тести складніші у виконанні, ніж експрес-тести, і вимагають великих витрат коштів.

Дана реакція (скорочено РІФ) використовується для діагностики сифілісу, у тому числі і прихованих форм, і повторної перевірки позитивних і хибнопозитивних проб.

РІФ заснована на світінні мічених антитіл при з'єднанні з комплексом антиген-антитіло під кварцовою лампою. Метод почав застосовуватися в 60-х роках і відрізнявся простотою виконання та високою специфічністю (яка трохи поступається РІБТ).

Він має кілька модифікацій: РІФ-10, РІФ-200 та РІФ-abs.

Найбільш чутлива РІФ у розведенні 10 разів, а інші - більш специфічні. РІФ проводиться у двох фазах. До артеріальної гіпертензії додають сироватку крові пацієнта. Утворюється комплекс АГ-АТ, що досліджується у наступній фазі. Далі мічений за допомогою флюоохром комплекс ідентифікують при мікроскопії. Якщо не спостерігається свічення, це вказує на відсутність специфічних АТ у сироватці крові.

РІФ-200 є найбільш цінним із усіх розведень. Метод призначений для діагностики різних формсифілісу, особливо прихованого сифілісу та повторної перевірки позитивних проб.

Реакція іммобілізації блідих трепонем (скорочено РІБТ, РІТ) одна із складних серологічних проб, що потребують значних зусиль та фінансових витрат. РИБТ застосовують дедалі рідше, але актуальність її зберігається у діагностиці прихованого сифілісу.

Велике значення вона несе у розпізнаванні хибнопозитивних результатів у вагітних жінок і ґрунтується на іммобілізації бактерій у присутності іммобілізинів – пізніх антитіл.

Результат оцінюється на відсотковій кількості (%) іммобілізованих трепонем за допомогою спеціальної таблиці:

1. 1 Від 0 до 20 – негативна проба.
2. 2 Від 21 до 50 – слабопозитивна проба.
3. 3 Від 50 додаткова реакція.

Неправдиві результати також можливі при застосуванні РІБТ. Так, невірна відповідь можлива при інфікуванні тропічними трепанематозами, а також при туберкульозі, цирозі печінки, саркоїдозі та пацієнтів похилого віку.

Цей аналіз крові на сифіліс називається реакцією пасивної гемаглютинації (скорочено кров на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА готують з еритроцитів барана, покритих фрагментами блідих трепонем (отриманих від інфікованих кроликів (див. рисунок 4)). Для аналізу використовується венозна кров (плазма чи інактивована сироватка) пацієнта.

При додаванні антигену в сироватку пацієнта із сифілісом відбувається утворення комплексу АГ-АТ, що призводить до аглютинації еритроцитів. аглютинація визначається суб'єктивно лікарем-лаборантом.

Рисунок 3 – Схема РПГА (реакція пасивної гемаглютинації)

Проба оцінюється як позитивна з появою аглютинатів рівномірного рожевого забарвлення. Фарбування преципітату в червоний свідчить про осадження еритроцитів. РПГА є високочутливою та високоспецифічною.

Реакція мікрогемаглютинації

Вона є спрощеним варіантом РПГА. Відрізняється від проби, описаної вище, меншою кількістю антигену, розріджувача та сироватки крові для виконання реакції. Через 4 години після інкубації сироватки можна оцінити пробу. Використовується при скринінгових та масових обстеженнях на сифіліс.

Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз (скорочено ІФА) базується на специфічній реакції антиген-антитіло. Біологічний матеріал (сироватка крові пацієнта, ліквор) вносять у лунки, на твердій поверхні яких фіксовано антигени блідої трепонеми. Досліджуваний матеріал інкубують, потім відмивають антитіла, які не зв'язалися з антигенами (див. рис. 5).

Ідентифікація отриманого комплексу складає етапі ферментації з допомогою імунної сироватки, міченої ферментом. При хімічної реакціїфермент забарвлює отримані комплекси. Інтенсивність фарбування залежить від кількості специфічних антитіл у крові пацієнта та фіксується спектрофотометром.

Малюнок 4 – Схема ІФА (імуноферментного аналізу)

Чутливість ІФА становить понад 95%. Метод використовується в автоматизованому режимі для дослідження декретованих груп населення: донорів, вагітних та інших, для уточнення діагнозу при позитивних та хибнопозитивних нетрепонемних тестах.

Імуноблот

Імуноблот - високочутливий метод, модифікація простого ІФА. Реакція заснована на електрофорез з розділенням антигенів блідих трепонем.

Розділені імунодетермінанти переносять на нітроцелюлозний папір і виявляють ІФА. Далі інкубують сироватку і змивають антитіла, що не зв'язалися. Отриманий матеріал обробляють імуноглобулінами (IgМ або IgG), міченими ферментом.

Клінічна оцінка результатів лабораторної діагностики сифілісу

У таблиці 1 нижче ми навели можливі результати аналізів та їх розшифрування. Як можна побачити в таблиці, основне значення при розшифровці має комплексна оцінка тестів.

Таблиця 1 – Розшифровка результатів серологічних реакцій (аналізів крові на сифіліс). Для перегляду клацніть по таблиці

Оцінка реактивності тестів виконується також «хрестами»:

1. 1 Максимальна відповідь (різко позитивна проба) позначається за допомогою 4-х хрестів.
2. 2 Позитивна проба позначається за допомогою трьох хрестів.
3. 3 Слабопозитивну реакцію позначають двома хрестами.
4. 4 Один хрест свідчить про сумнівний та негативний результат.
5. 5 Негативну відповідь маркують знаком «мінус».

Проблема оптимізації лабораторної діагностики сифілісу не втратила своєї актуальності до нашого часу. Сучасні методи діагностики, незважаючи на прагнення вчених привести діагностику до максимально високих показників чутливості та специфічності, потребують контрольної перевірки та індивідуального підходу.

Особливістю сифілітичної інфекції є феномен серорезистентності, який не отримав наукового пояснення. Діагноз виставляється після повноцінного обстеження хворого на епідеміологічні, клінічні, лабораторні методи.

На тлі економіко-технічного розвитку медицини спостерігається прогрес у розробці нових критеріїв діагностики сифілісу. Все це дозволить швидко, успішно та безпомилково лікувати пацієнтів.